Связь стресса с дофаминергической системой.

Дофамин регулирует поведение, связанное с вознаграждением, посредством мезолимбического дофаминергического пути. Стресс влияет на уровень дофамина и дофаминергическую нейрональную активность в мезолимбической дофаминовой системе. Изменения мезолимбической дофаминергической нейротрансмиссии важны для преодоления стресса, поскольку они позволяют адаптироваться к поведенческим реакциям на различные раздражители окружающей среды. При воздействии стресса модуляция дофаминергической системы необходима для мониторинга и выбора оптимального процесса преодоления стрессовых ситуаций. Стрессовые события могут негативно регулировать дофаминергическую систему, нарушая чувствительность к вознаграждению, которая тесно связана с хронической депрессией, вызванной стрессом.

Нарушение дофаминергической передачи повлияет на поведение, связанное со способностью воспринимать изменения окружающей среды и приспосабливаться под эти изменения, что играет важную роль в  психологическом здоровье организма. Учитывая вышеперечисленные данные, можно сказать о том, что дофамин является главным нейромедиатором «системы поощрения» мозга, поскольку вызывает чувства удовольствия и предвкушения (или ожидания) удовольствия (или удовлетворения), чем влияет на процессы мотивации и обучения [Pfni et al., 2000].

Существует достаточно доклинических данных, подтверждающих мнение о том, что стресс, как в острой, так и в хронической форме, может оказывать негативное влияние на нормальную физиологию дофаминергической системы.

Так, стресс может вызвать следующие изменения у потомства взрослых крыс: (i) значительное увеличение связывания рецептора D2 в NAc; и (ii) значительное снижение связывания рецептора D3 как в оболочке, так и в ядре NAc. 56 Вариации в экспрессии генов или посттрансляционные модификации могут объяснять изменения плотности и сродства рецепторов D2, которые были обнаружены у крыс, подвергшихся 2-часовому стрессу, 57 гипертермии или лечению скипидаром. 58

Большое количество недавних данных способствовало признанию дофаминергической иннервации как важной системы для определения реакций на возмущения в условиях окружающей среды, для выборочной обработки информации и для управления эмоциональным поведением, все из которых играют важную роль в способности (или неудача) справиться с внешним миром [Pani et al., 2000].

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы и оборудования

1. Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) - 0,5 М;

2. Додецилсульфат натрия (SDS) – 10 %;

3. Натрий хлористый (NaCl) – 0,2 М;

4. Магний хлористый (MgCl2) – 0,2 М;

5. Сахароза – 1 М;

6. Тритон Х – 100;

7. Трис-HCl – 1 М (pН 7.6, 8.0);

8. Насыщенный фенол, pH 7.8;

9. Хлороформ/изоамиловый спирт (24:1);

10.  Этанол 96%, 70%, 10%;

11.  Протеиназа P – 10 мкг/мл;

12.  1% HNO3;

13.  0.012 М Ag NO3;

14.  0.28 М Na2CO3 + 38% формальдегид;

15.  10% CH3COOH;

16.  Дистиллированная вода;

17.  Вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания);

18.  Морозильник/холодильник;

19.  Водяная баня на 95°С;

20.  Микроцентрифуга на 10000-14000 об/мин;

21.  Программируемый термоциклep (Терцик), амплификатор «My Cycler» фирмы Biorad;

22.  Пробирки типа «Eppendorf» на 1,5 и 2,0 мл;

23.  Пробирки для ПЦР на 0.6 мл;

24.  Полуавтоматические микропипетки на 2-20 мкл и 20-200 мкл;

25.  Центрифуга фирмы Biorad до 3500 об/мин;

26.  Термошейкер для планшетов PST-60HL/PST-60HL-4 (SIA «BioSan», Латвия);

27.  NanoPhotometer P360(IMPLEN, Германия;

28.  CFX 96 Real-Time System;

29.  Thermo Shaker BIOSAN TS-100;

30.  TRIzol Reagent;

31.  Изопропиловый спирт (C₃H₈O);

32.  Набор реагентов для проведения обратной транскрипции MMLV RT kit «Евроген», Россия;

33.  RNaseZap® RNase Decontamination Solution (ThermoFisher scientific, США);

34.  Вода, свободная от РНКаз;

35.  MilliQ;

36.  8-луночные стрипы для проведения ПЦР и ОТ, прозрачные

Объекты исследования.

Для моделирования воздействия различных типов хронического стресса сформировано 4 группы крыс линии Вистар (30 самцов, 10 самок) в возрасте 6 месяцев, подвергавшихся разным видам стрессорного воздействия на протяжении 6 месяцев.

Первая группа («Контроль», n=9) содержалась в обычных условиях вивария без воздействия какой- либо нагрузки. Животные второй группы («Плавание», n=12) испытывали стресс в виде интенсивной физической нагрузки (7 минут с грузом 8% от массы тела) в водном лабиринте Морриса (Open Science, Россия). У животных третьей группы («Иммобилизационный стресс», «ИС», n=9) хронический стресс вызывался ежедневной 90- минутной иммобилизацией в специальном пенале- фиксаторе (Open Science, Россия) в течение 14 дней. Четвертая группа («Плавание+ИС», n=10) включала комплексную комбинацию стрессовой нагрузки путем теста вынужденного плавания и иммобилизации.

Относительный уровень экспрессии генов определяли на 3-й и 6-й месяц эксперимента в образцах РНК, выделенных из венозной крови из хвостовой вены. Выделение РНК проводили с использованием реагента ExtractRNA (Евроген, Россия) согласно инструкции фирмы-производителя; качество и количество образцов оценивали спектрофотометрически на приборе NanoDrop Lite (ThermoFisher, США). Для синтеза кДНК использовали вырожденные праймеры с использованием MMLV RT kit (Евроген, Россия). Относительный уровень экспрессии генов оценивали методом 2-ΔΔCt [Livak, Schmittgen, 2001] на основании результатов, полученных в ходе ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов (Applied Biosystems, США) достоверность различий определялась с использованием непараметрического статистического критерия t-тeст, различия считались достоверными при р<0.05.

Работа выполнялась на базе ЦНИЛ КГМУ и К(П)ФУ с период с апреля 2019 года по май 2021 года. Опыты проводили на половозрелых крысах, выполнены на 88 лабораторных крысах линии Wistar массой 200–500 г, возрастом 4–6 мес. Крысы относились к линии Wistar в возрасте 3 (1-ая партия) и 6 месяцев (2 партия). Первая партия, которая поступила в сентябре 2019 года, состоит из 40 крыс из которых 30 самцы, 10 самок. Вторая партия, которая поступила в феврале 2020 года состояла из 49 крыс, из которых 26 самок, 23 —самца.

Опыты проводили на половозрелых самцах

мышей линии C57BL/6J в возрасте 2.5–3 мес. Все

процедуры осуществляли в соответствии с меж-

дународными правилами и стандартами, приме-

няемыми при работе с животными (European

Communities Council Directive (86/609/EEC)) и

одобренными Комиссией по биоэтике ИЦиГ СО

РАН (Март, 24, 2010, N 613.)

Животные содержались в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, свободный доступ к пище и воде, температура воздуха 20 ± 2 °C). Контрольные группы состояли из животных тех же партий, содержавшихся в аналогичных условиях. Bсследования соответствуют основным требованиям биомедицинской этики (European convention for the protection of vertebrate animals…, 1986).

Крыс распределяли на экспериментальные группы по типам характера с помощью теста Порсолта, который включает в себя принудительное погружение в воду организма и наблюдение за характером действия крыс. Данный тест основан на том, что грызуны, будучи помещенными в прозрачный цилиндр, наполненный водой, из которого невозможно выбраться, будут действовать по-разному. Одни довольно быстро прекращают попытки выбраться из него и просто замирают в ожидании. Другие же наоборот, начинают активно двигаться. Первое поведение интерпретируется как пассивная стратегия борьбы со стрессом (поведенческое отчаяние). Данных крыс мы относили к группе пассивных. Второе указанное поведение относится к крысам с активной деятельностью. Необходимо отметить, что крыс, которых нельзя было отнести ни к одной из приведённых групп, так как не было точно ясно, какой у них тип характера, мы в эксперимент не брали.

Для моделирования воздействия различных типов хронического стресса сформировано 4 группы крыс. I группа (n=9) – интактные крысы; II группа (плавание, n=12) – крысы испытывали стресс в виде интенсивной физической нагрузки (7 минут с грузом 8 % от массы тела) в лабиринте Морриса. У крыс III группы хронический стресс вызывался 90-минутной иммобилизацией в специальном фиксаторе в течение 14 дней (иммобилизационный стресс, ИС, n=9). IV группа (плавание + ИС, n=10) включала комплексную комбинацию стрессовой нагрузки из II и III группы.

Стрессовый фактор был вызван гиподинамией крыс, путём закручивания подопытных в тканевый материал, с помощью чего обеспечивалась обездвиживание крыс. Осуществление стресс-теста происходило в течение двух недель подряд каждый день на протяжении двух недель перед контрольными точками.. Испытуемые находились в обездвиживании в течение 90 минут.

Физические нагрузки давались с грузом 7% от массы тела и запускались в бассейн, используемый для теста Мориса, на плавание на 6-10 минут. Время нагрузки подбиралась в зависимости от адаптивных возможностей и физического состояния подопытного организма.

Фаза стресса, связанная с умеренными физическими нагрузками на первом этапе, включала в себя помещение крыс в бассейн на 6 минут. Размеры бассейна: от 1 до 2 м. Температура воды – 20-24 градуса, после плавания использовали батарею для обогрева животных.

Относительный уровень экспрессии генов определяли на 3-й и 6-й месяц эксперимента в образцах РНК, выделенных из крови хвостовой вены. Забор крови для определения теломеразной активности и уровня гормонов осуществлялся в вивариуме КГМУ (г. Казань). Забор крови проводили из латеральной хвостовой вены или вентральной/дорсальной артерии. Перед взятием крови опускали хвост крыс в тёплую воду для улучшения кровообращения и быстрому выделения образцов крови.

После взятия крови получали фракцию лейкоцитов путем центрифугирования в градиенте фиколла, подсчёт лейкоцитов осуществлялся с помощью ручного метода в счетной камере Горяева.