Научный руководитель: Забазнов К. Г.

Кафедра хирургических болезней №1

ФГБОУ ВО РостГМУ

г. Ростов-на-Дону, Россия.

Ключевые слова: терапевтический ангиогенез, ишемия, гены, клеточная терапия.

Актуальность исследования. Несмотря на принципиальные изменения в диагностике и лечении сердечно-сосудистой системы, смертность от заболеваний, связанных с ишемическими состояниями, составляет 17,9 миллионов жизней ежегодно в мире, из которых 85% - смерти от инфаркта и инсульта [9], что диктует необходимость поиска и применения инновационных способов лечения больных с ишемической болезнью сердца (ИБС), цереброваскулярными патологиями и ишемическими состояниями периферических сосудов. Таким инновационным методом является терапевтический ангиогенез, улучшающий кровооснабжение ишемизированных тканей.

Научная новизна состоит в систематизации и обобщении различных методов терапевтического ангиогенеза, а также в рассмотрении последних результатов экспериментальных и клинических исследований, позволяющих оценить перспективы применения данного способа лечения в сердечно-сосудистой хирургии.

Рост и образование сосудов осуществляется через васкулогенез, артериогенез и ангиогенез. Ангиогенез представляет собой образование новых капилляров, что происходит через активацию эндотелиальных клеток, синтез в них протеаз, деградацию внеклеточного матрикса, пролиферацию и миграцию этих клеток, образование ими первичных сосудистых структур, последующую стабилизацию и "взросление" этих структур за счет привлечения перицитов и гладкомышечных клеток и организации их в сложную трехмерную сосудистую сеть. Основным стимулом к ангиогенезу при физиологических и патологических состояниях является недостаток кислорода (гипоксия, ишемия), который через активатор транскрипции факторов ангиогенеза – HIF-1, индуцирует экспрессию многих ангиогенных факторов и прежде всего основного регулятора ангиогенеза – сосудистого эндотериального фактора роста (VEGF) и его рецепторов. VEGFs избирательно стимулируют пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, их предшественников и моноцитов, экспрессирующих рецепторы к нему, увеличивают сосудистую проницаемость, способствуя пропотеванию белков плазмы в околососудистое пространство, которое необходимо для миграции ЭК, индуцируют экспрессию эндотелиальной NO-синтазы. Артериогенез – образование

артерий из предшествующих анастомозов. Васкулогенез – это формирование in situ кровеносных сосудов из прогениторных эндотелиальных клеток (ПЭК) [4].

Обеспечивает реваскуляризацию ишемизированных участков за счет стимуляции образования и роста сосудов терапевтический ангиогенез. Он представляет собой многообразные методы, которые используют различные ангиогенные факторы, включая VEGFs (охватывает семейство из 6 факторов), факторы роста фибробластов (FGFs) (включает семейство 20 факторов), гепацитарный фактор роста (HGF). Они используются либо в виде рекомбинантных белков, либо в конструкциях в плазмидном или аденовирусном векторе. Также в последние годы развивается неоваскуляризация путем клеточной терапии [4].

Большинство исследований в сфере геннотерапевтической стимуляции ангиогенеза посвящены генам VEGFs и FGFs (VEGF165 и VEGF121; FGF1 и FGF4; др). Перенос гена в клетки ишемизированных тканей вызывает индукцию синтеза закодированных им белков, и как следствие, инициацию роста и развития сосудов [8]. Для доставки гена используются ДНК-плазмиды и аденовирусные векторы. Аденовирусные векторы обеспечивают экспрессию более длительно, чем ДНК-плазмиды, однако применение данных переносчиков может сопровождаться переходящей лихорадкой, повышением С-реактивного белка, ферментов печени и увеличением титра аденовирусных антител [16].

Согласно многочисленным исследованиям, введение непосредственно в ишемический миокард плазмидной ДНК, кодирующей ген VEGF165, улучшает перфузию миокарда, что видно на однофотонной эмиссионной компьютерной томографии. Интрамиокардиальная доставка плазмидной ДНК, кодирующей ген VEGF-2, уменьшала ишемию при электромеханическом картировании. Однако, согласно исследованию AGENT по интракоронарному введению аденовирусного вектора, кодирующего ген FGF-4, произошло лишь незначительное улучшение времени физической нагрузки у пациентов со стенокардией 2 или 3 класса CCS. При последующем анализе данных, полученных в разных подгруппах больных, было установлено, что генная терапия достоверно увеличивала толерантность к физической нагрузке в сравнении с контролем у пациентов старше 55 лет и с более тяжелой формой стенокардии (4 класс) [11].

В исследовании M. Hedman опубликованы результаты 8-летних наблюдений в рамках сравнительного плацебо-контролируемого клинического исследования безопасности препаратов на основе аденовирусного вектора и ДНК-плазмид с геном VEGF165 в лечении пациентов с ИБС, планирующихся для хирургического лечения (n = 103). Всем пациентам в ходе коронарной ангиопластики или стентирования выполнялись интрамиокардиальные инъекции препаратов. В результате, статистически значимых

различий в 8-летней выживаемости пациентов (82% суммарно), а также в развитии неблагоприятных явлений обнаружено не было [3].

Таким образом, результаты лечения ИБС неоднозначны, что, возможно, связано с несоответствием многих экспериментальных моделей ишемии тканей и особенностей реваскуляризации миокарда у человека и животных, на которых выполнялись начальные исследования, а также с различным введением доз и длительностью терапии.

На сегодняшний день в Российской Федерации зарегистрирован и применяется единственный препарат терапевтического ангиогенеза - «Неоваскулген», представляющий собой высокоочищенную сверхскрученную форму плазмиды pCMV-VEGF165, кодирующей фактор VEGF под контролем промотора (управляющего участка ДНК). Препарат применяется как у неоперабельных, так и у операбельных пациентов (для улучшения результатов реконструктивных операций), и оказывает эффект при хронической ишемии нижних конечностей (ХИНК) и при критической ишемии нижних конечностей (КИНК) (2а, 2б и 3 стадии заболевания по классификации Покровского-Фонтейна). Препарат вводится в мышцы ишемизированной конечности пациента, что приводит к увеличению количества сосудов в местах инъекции и, соответственно, к улучшению кровоснабжения и снижению выраженности хронической ишемии, увеличению дистанции безболевой ходьбы [1,6]. Также опубликованы результаты успешных пилотных исследований применения препарата на основе гена VEGF165 у пациентов с синдромом диабетической стопы. Применение pl-VEGF165 в составе комплексного лечения позволило добиться заживления ран у 65,7% больных с хроническими язвенными дефектами и сохранность целевой конечности у 84% (при n=35) [5].

В последние годы новые надежды в области терапевтического ангиогенеза связаны с разработкой технологии клеточной терапии. В ней могут использоваться как стволовые клетки костного мозга (СК), так и ПЭК, и мезенхиальные клетки.

Трансплантация увеличенных в культуре ПЭК может успешно увеличить ангиогенез и кровоснабжение тканей, однако данная методика получила распространение только в экспериментальных моделях животных из-за трудностей в методах увеличения культуры и ограниченного количества ПЭК для имплантации [17].

Механизм репаративного действия СК включает паракринные эффекты, связанные с их секреторной активностью, дифференцировку в специфические клетки ткани и сосудов и слияние с клетками ткани, что позволяет придать им новые свойства [4]. CD34+ фракция мононуклеаров костного мозга, синтезирующая ангиогенетические ростовые факторы (VEGF, bFGF), ангиопоэтин I, эффективно используется для имплантации [14].

В большом клиническом исследовании под названием «Терапевтический ангиогенез с трансплантацией клеток (ТАКТ) при внутримышечном введении мононуклеаров костного мозга был продемонстрирован 60% уровень сохранения конечности в 3-летний период, а также снижение выраженности боли, увеличение дистанции ходьбы и улучшение заживления трофических язв в 2-летний период. При этом показатели лодыжечно-плечевого индекса (ЛПИ) и транскутанного напряжения кислорода между группами не отличались [15].

В исследовании Суковатых Б.С. и соавт. III стадии КИНК объемный кровоток в ишемизированной конечности после имплантации СК был выше в 2,1 раза, чем после реваскуляризирующей остеотрепанации и в 2, чем после поясничной симпатэкмии, магистральный кровоток, соответственно, в 1,6 и 1,4 раза, уровень микроциркуляции - на 8,8% и 13,3%, дистанция безболевой ходьбы - на 19 и 27 м. Однолетняя клиническая эффективность клеток аутологичного костного мозга составила 94% [7].

В исследовании HARVEST также продемонстрировано положительное воздействие клеточной терапии концентрированного аспирата костного мозга при внутримышечном введении на частоту ампутаций, выраженность болевого синдрома, качество жизни, оценку ишемии по шкале Рутерфорда и ЛПИ в сравнении с контролем [10]. D.H. Walter пациентам с КИНК (20 наблюдений, 20 — контрольная группа) внутриартериально вводил клетки мононуклеарной фракции аутологичного костного мозга. Через 3 месяца был установлен достоверный эффект уменьшения интенсивности болевого синдрома в покое и размеров язв [2, 18].

Соответственно, применение СК в лечении ХИНК и КИНК демонстрирует в большинстве случаев уменьшение интенсивности болевого синдрома в покое, увеличение дистанции безболевой ходьбы, нормализацию ЛПИ.

В исследовании Ли и др. [13] было показано, что клеточная терапия с использованием аутологичных стволовых клеток жировой ткани (ADRC) осуществима и эффективна для увеличения кровотока, уменьшения боли, улучшения клинических исходов у пациентов с болезнью Бургера и синдромом диабетической стопы. Последние научные исследования посвящены применению ADRS у пациентов с КИНК. Пилотное клиническое исследование «Терапевтический ангиогенез путем трансплантации клеток с использованием ADRC» (TACT-ADRC) было начато в Японии. В результате ни одному пациенту не потребовалась ампутация большой конечности, и ишемические язвы частично или полностью зажили в течение 6 месяцев наблюдения. Во всех случаях наблюдались значительные клинические улучшения в отношении боли в состоянии покоя и ходьбы [12].

Выводы:

1. Терапевтический ангиогенез является важной и перспективной стратегией лечения ишемических заболеваний сердечно-сосудистой системы (в частности ХИНК и КИНК), что подтверждается полученными данными международных и российских исследований за последние 15 лет.

2. В связи с неоднозначностью интерпретации некоторых исследований остается открытым вопрос о внедрении в практическое использование данного метода в лечении ИБС и широком применении клеточной и генной терапии.

3. В дальнейшем с оптимизацией организации исследований и увеличением выборки пациентов эти инновационные технологии в большем количестве войдут в практику сердечно-сосудистой хирургии, ведь начало данному процессу уже положено.

Список литературы:

1. Деев Р.В., Калинин Р.Е., Червяков Ю.В., Грязнов С.В., Мжаванадзе Н.Д., Киселев С.Л., Исаев А.А., Швальб П.Г., Староверов И.Н., Нерсесян Е.Г. Результаты применения гентерапевтического препарата «Неоваскулген» у пациентов с хронической ишемией нижних конечностей: 1 год наблюдений // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова. – 2015. – Том 6.- №4. – С. 20-25.

2. Зорькин А.А., Дрожжин Е.В., Кательницкий И.И., Мазайшвили К.В. Терапевтический ангиогенез у больных с облитерирующими заболеваниями артерий и синдромом критической ишемии нижних конечностей: возможности терапии с позиций доказательной медицины // ПМ. - 2018. - №6. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/terapevticheskiy-angiogenez-u-bolnyh-s-obliteriruyuschimi-zabolevaniyami-arteriy-i-sindromom-kriticheskoy-ishemii-nizhnih (дата обращения: 27.12.2020).

3. Мжаванадзе Н.Д., Калинин Р.Е., Исаев А.А., Деев Р.В. Становление и развитие терапевтического ангиогенеза в российской сердечно-сосудистой хирургии // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. – 2015.- №6.-С. 91-97.

4. Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Терапевтический ангиогенез: достижения, проблемы, перспективы//Кардиологический вестник. – 2007.- Том 02. - №2. – С. 5-15

5. Плакса И. Л., Мжаванадзе Н. Д., Калинин Р. Е., Сучков И. А., Бакунов М. Ю., Кривихин В. Т., Матвеев С. А., Исаев А. А., Деев Р. В. Пилотное исследование безопасности и эффективности ангиогенной терапии при синдроме диабетической стопы // Сахарный диабет. - 2019. - №6. – С.559-567.

6. Регистр лекарственных средств России [Электронный ресурс]: Энциклопедия лекарств и товаров аптечного ассортимента: Неоваскулген (Neovasculgen).- URL.: https://www.rlsnet.ru/tn_index_id_48857.htm (дата обращения: 27.12.2020).

7. Суковатых Б.С., Орлова А.Ю., Суковатых М.Б., Боломатов Н.В. Гемодинамическая и клиническая эффективность трансплантации клеток аутологичного костного мозга при лечении пауиентов критической ишемией нижних конечностей // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н. И. Пирогова. - 2020. - №1. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/gemodinamicheskaya-i-klinicheskaya-effektivnost-transplantatsii-kletok-autologichnogo-kostnogo-mozga-pri-lechenii-patsientov-s (дата обращения: 27.12.2020).

8. Червяков Ю.В., Староверов И.Н., Нерсесян Е.Г., Исаев А.А., Деев Р.В. Терапетический ангиогенез в лечении больных с хроническими облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей. Ближайшие и отдаленные результаты // Ангиология и сосудистая хирургия. – 2012. - №3. – С.19-27. 9. Cardiovascular diseases (CVDs). Key facts 2017, 2017. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds).

9. Iafrati M.D., Hallett J.W., Geils G., et al. Early results and lessons learned from a multicenter, randomized, double-blind trial of bone marrow aspirate concentrate in critical limb ischemia // J. Vasc. Surg. ― 2011. ― Vol. 54 (6). ― P. 1650-1658.

10. Jo DH, Kim JH. Toward the Clinical Application of Therapeutic Angiogenesis Against Pediatric Ischemic Retinopathy. J Lipid Atheroscler. 2020 May;9(2):268-282. doi: 10.12997/jla.2020.9.2.268. Epub 2020 May 18. PMID: 32821736; PMCID: PMC7379088.

11. Katagiri T, Kondo K, Shibata R, Hayashida R, Shintani S, Yamaguchi S, Shimizu Y, Unno K, Kikuchi R, Kodama A, Takanari K, Kamei Y, Komori K, Murohara T. Therapeutic angiogenesis using autologous adipose-derived regenerative cells in patients with critical limb ischaemia in Japan: a clinical pilot study. Sci Rep. 2020 Sep 29;10(1):16045. doi: 10.1038/s41598-020-73096-y. PMID: 32994527; PMCID: PMC7525513.

12. Lee HC, An SG, Lee HW, et al. Safety and effect of adipose tissue-derived stem cell implantation in patients with critical limb ischemia: a pilot study. Circ J 2012;76:1750–1760.

13. Liotta F., Annunziato F., Castellani S., et al. Therapeutic efficacy of autologous non-mobilized enriched circulating endothelial progenitors in patients with critical limb ischemia ― The SCELTA Trial // Circ. J. ― 2018. ― Vol. 82 (6). ― P. 1688-1698.

14. Matoba S., Tatsumi T., Murohara T., et al. Long-term clinical outcome after intramuscular implantation of bone marrow mononuclear cells (Therapeutic Angiogenesis by Cell Transplantation [TACT] trial) in patients with chronic limb ischemia // Am. Heart J. ― 2008. ― Vol. 156 (5). ― P. 1010-1018.

15. Meyer F., Finer M. Gene therapy: progress and challenges. Cell Moi Biol (Noisy-le-grand). 2014; 47: 1277-94.

16. Murohara T. Therapeutic Angiogenesis with Somatic Stem Cell Transplantation. Korean Circ J. 2020 Jan;50(1):12-21. doi: 10.4070/kcj.2019.0288. PMID: 31854154; PMCID: PMC6923231.

17. Walter D.H., Krankenberg H., Balzer J.O., Kalka C., Baumgartner I., Schluter M., Tonn T., Seeger F., Dimmeler S., Lindhoff-Last E., Zeiher A.M. Intraarterial administration of bone marrow mononuclear cells in patients with critical limb ischemia: a randomized-start, placebo-controlled pilot trial (PROVASA). Circ. Cardiovasc. Interv. 2011; 4 (1): 26–37.