Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного

Разработка системы оплодотворения и обеспечения ранних стадий развития эмбрионов млекопитающих вне живого организма (in vitro) имеет большое значение для решения ряда научных задач и практических вопросов по повышению эффективности разведения животных.

 

Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro включает следующие этапы:

1. Созревание ооцитов in vitro. Ооциты получают из яичников коровы после убоя животных. Яичники доставляют в лабораторию в термостатированном контейнере в течение 1,5 - 2 часов. Там их дважды промывают свежим фосфатным буфером. Ооциты извлекают из фолликулов путем отсасывания или разрезания яичников на пластинки. Ооциты собирают в среду ТСМ 199 с добавлением 10 % сыворотки крови от коровы в охоте, затем дважды промывают и отбирают для дальнейшего созревания in vitro ооциты с компактным кумулюсом и однородной цитоплазмой.

В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора или лапароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр которых не менее 2 мм, 1 - 2 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем получают однократно 5-6 ооцитов на животное. Для созревания in vitro пригодно менее 50% ооцитов.

Отобранные ооциты созревают в течение 24 часов в среде ТСМ 199 с добавлением 20 % обработанной теплом сыворотки крови от коровы в охоте, гранулезных клеток и небольшого количества антибиотиков (пенициллина, стрептомицина).

2. Капацитация сперматозоидов. До того как сперматозоид приобретает способность к оплодотворению, в нем должны произойти некоторые физиологические изменения. Этот процесс получил название капацитация.

Капацитация включает две фазы: 1) изменение мембраны спермия (собственно капацитация); 2) акросомная реакция.

Разработаны следующие методы капацитации спермиев: использование среды с высокой ионной силой; использование гликозаминогликана гепарина.

 

3. Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов (на примере КРС). Оплодотворение in vitro проводят в капле модифицированной среды Тироида. После созревания in vitro ооциты частично очищают от окружающих кумулюсных клеток и переносят в микрокапле по пять ооцитов в каждой. Суспензия сперматозоидов объемом 2 - 5 мкл добавляется к среде с ооцитами, чтобы достичь концентрации сперматозоидов в каплях 1,0 - 1,5 млн./мл. Через 44 - 48 часов после осеменения определяют наличие дробления ооцитов. Затем эмбрионы помещают в монослой эпителиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5 дней.

Межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных. Пересадка эмбрионов, например, овец козам и наоборот сопровождается их приживляемостью, но не завершается рождением потомства. Во всех случаях межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов является нарушение функции плаценты за счет иммунологической реакции материнского организма на инородные антигены плода. Эта несовместимость может быть преодолена получением химерных эмбрионов с помощью микрохирургии.

 

Клонирование животных

 

Ядро соматической клетки обладает полной генетической информацией о данном организме. Если создать условия для реализации этой информации, то можно получить неограниченное число генетических копий (клонов) определенной особи.

Получение однояйцовых близнецов – имеет большое значение для животноводства. При этом увеличивается выход телят от одного донора, появляются генетически идентичные двойни. Для этого эмбрионы млекопитающих на ранних стадиях развития разделяют микрохирургическим путем на две или более частей. Они в последующем развиваются в отдельный организм. Разделенные эмбрионы коров могут храниться в замороженном состоянии.

Клонирование эмбрионов путем пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные (лишенные ядра) яйцеклетки. Включает следующие этапы: выделение интактного ядра донора; энуклеация ооцита; пересадка ядра в энуклеированную яйцеклетку; активация ооцита и слияние мембран яйца и ооцита под действием электрического импульса.

Данная технология позволяет получить из отдельной эмбриональной клетки множественные копии генетически одинаковых животных (до 64). Повторное клонирование полученных этим методом эмбрионов повышает потенциальные возможности технологии в производстве большого числа клонов.

Клонирование животных путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки – метод позволяет получить не только одинаковых между собой животных, но и идентичных по генотипу с животными-донорами соматических клеток. Эта технология может быть использована для сохранения исчезающих пород животных.

Вопросы для самоконтроля

 

1) Значение трансплантации эмбрионов для животноводства.

2) Перечислите основные этапы технологии трансплантации эмбрионов.

3) Требования, предъявляемые к коровам-донорам и коровам-реципиентам.

4) Техника вызывания суперовуляции и искусственное осеменение коров-доноров.

5) Способы извлечения эмбрионов.

6) Оценка эмбрионов.

7) Способы пересадки эмбрионов реципиентам.

8) Консервация эмбрионов.

9) Технология оплодотворения яйцеклеток млекопитающих in vitro.

10) Межвидовые пересадки эмбрионов.

11) Методы клонирования животных.

 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Основная

 

1. Блинов, В.А. Общая биотехнология: Курс лекций. В 2-х частях. Ч. 2. – Саратов: ФГОУ ВПО «Саратовский СГАУ», 2004. – 144 с. – ISBN 5-7011-0436-2

2. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. / Б. Глик, Дж. Пастернак.– М: Мир, 2002. – 589 с.

3. Елинов, Н.П. Основы биотехнологии / Н.П. Елинов. – СПб.: Наука, 1995. – ISBN 5-02-026027-4

4. Клунова, С.М. Биотехнология: учебник / С.М. Клунова, Т.А. Егорова, Е.А. Живухина. – М.: Академия, 2010. – 256 с. – ISBN 978-5-7695-6697-4

5. Марченко, Г.Г. Гибридизация животных / Г.Г. Марченко, О.И. Бирюков, Т.С. Преображенская. – Саратов: ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2008. – 84 с.

6. Никульников, В.С. Биотехнология в животноводстве: учебное пособие / В.С. Никульников, В.К. Кретинин. – М.: Колос, 2007. – 544 с. – ISBN 978-5-10-003966-2

7. Сельскохозяйственная биотехнология / Шевелуха В.С. и др. – М.: Высшая школа, 2003. – 427 с. – ISBN: 5-06-004264-2

8. Тарантул, В.З. Толковый биотехнологический словарь русско-английский: справочное издание [Электронный ресурс] / В.З. Тарантул. – М.: Языки славянских культур, 2009. – 936 с. – ISBN: 978-5-95-51-0342-6 – Доступ с сайта научной библиотеки СГАУ – ЭБС IPRbooks

 

Дополнительная

 

1. Биотехнология: учебное пособие для вузов, в 8 кн., под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М., 1987.

2. Журнал «Биотехнология» (аннотации статей) (ссылка доступа – http://www.genetika.ru/journal)

3. Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» (ссылка доступа – http://cbio.ru)

4. Оn-line-журнал «Биотехнология. Теория и практика» (ссылка доступа – http://www.biotechlink.org)

 

Лекция 10

 

ТРАНСГЕННЫЕ ЖИВОТНЫЕ