Определение фагоцитарной способности лейкоцитов крови

Одним из главных свойств лейкоцитов является способность к фагоцитозу. Лейкоциты поглощают микроорганизмы и инородные частицы, попадающие в организм животного. Таким образом организм животного освобождается от болезнетворных микробов и посторонних частиц, вредящих тканям. Захваченные лейкоцитами микробы перевариваются под влиянием ферментов, находящихся в лейкоцитах, а инородные посторонние частицы переносятся лейкоцитами и удаляются из организма вместе с выделениями тела. Поглощение микробов и посторонних частиц можно наблюдать и на переживающих лейкоцитах, находящихся в пробирке.

Наиболее просты и удобны следующие методы исследования фагоцитоза. Метод Платонова (видоизмененный Голодец Г.Г.). В специальные короткие пробирки емкостью 2—3 мл с длинным оттянутым нижним концом вводят смесителем для белых кровяных телец 1 объем разбавленной в 10 раз крови. Для этой цели нужно насосать кровь в смеситель до отметки 1, а затем до отметки 11 насосать физиологический раствор (0,95%-й NaCI). Затем тем же смесителем в пробирку вводят равный объем физиологического раствора. После этого этим же смесителем в пробирку добавляют 1 объем взвеси микробов

кишечной палочки в физиологическом растворе, смытый с агаровой культуры. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и помещают на 25 мин.

в  термостат  при  температуре  37°С.  Чтобы  кровяные  тельца  не  оседали,  пробирки помещают наклонно в зажимы, укрепленные на ось моторчика Уоррена (делающего 2—3 оборота в минуту).

Через 25 мин. пробирки вынимают из термостата и в каждую прибавляют по 1 капле 1%-го раствора осмиевой кислоты для приостановки фагоцитоза. После этого пробирки центрифугируют в течение 3 мин при частоте оборотов не свыше 1000 в минуту. В результате этого красные кровяные тельца, как наиболее тяжелые, попадают в нижнюю часть узкого конца пробирки, а сверху располагается слой лейкоцитов в виде тонкой белесоватой пленки.

Верхний прозрачный слой жидкости отсасывают пастеровской пипеткой до поверхности осевших форменных элементов. Затем этой же пипеткой отсасывают верхний слой лейкоцитов, переносят на предметное стекло и делают мазок. Чтобы не повредить лейкоциты, покровное стекло при проведении мазка следует держать несколько навесу, не касаясь его краем предметного стекла. При достаточной величине капли это не составляет затруднения.

Мазок затем высушивают и фиксируют 3 мин метиловым спиртом. Далее мазок окрашивают по Романовскому. Кишечная палочка окрашивается в темно-фиолетовый цвет и легко различима в протоплазме лейкоцитов. Окрашенный мазок рассматривают под микроскопом с иммерсией и отмечают количество кишечных палочек, захваченных каждым полиморфноядерным лейкоцитом.

Подсчет необходимо делать в четырех местах мазка. Принимают в расчет только те микробы, которые захвачены лейкоцитами внутрь протоплазмы, а не прилегают к лейкоциту извне. Для удобства записи вычерчивают таблицу из 200 клеток. В каждую клетку записывают число микробов, захваченных одним лейкоцитом. При подсчете учитывают и не фагоцитировавшие лейкоциты, ставя в очередную клеточку таблицы 0. После просчета 200 лейкоцитов находят общую сумму захваченных этими лейкоцитами микробов. Полученное число выражает силу фагоцитоза данной крови.

Метод Пучкова и Титовой. Лейкоциты поглощают не только микробы, но и частицы инородных веществ. Поэтому можно наблюдать фагоцитоз, прибавляя к крови вместо микробов взвесь мелких частиц какого-либо индифферентного вещества. Преимущество этого способа по сравнению с описанным выше заключается в легкости подсчета.

Для фагоцитоза используют взвесь зернышек кармина. Эту взвесь приготовляют заранее: 1 г кармина (накарат) растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством физиологического раствора в течение 15 мин. После этого растертый кармин смывают физиологическим раствором в коническую колбу емкостью 200—250 мл и доводят объем жидкости до 150 мл. Взвесь кармина взбалтывают и оставляют до тех пор, пока не осядет кармин.

Затем верхний слой жидкости, образовавшийся над осевшим кармином и окрашенный в красный цвет, отсасывают пипеткой с помощью резиновой груши. Раствор доводят до прежнего объема, взбалтывают и снова после осаждения кармина отсасывают верхний слой жидкости. Так поступают несколько раз, чтобы освободить раствор от слишком мелких коллоидных частиц краски. Приготовленная взвесь сохраняется месяцами и даже годами, и ее можно употреблять очень долгое время.

Взвесь кармина взбалтывают за день до опыта. На другой день в колбе со взвесью сверху образуется прозрачный слой жидкости, более или менее резко отграниченный от верхнего слоя еще не осевших зернышек кармина. Пастеровскую пипетку вводят в жидкость на 2 см ниже верхнего слоя оседающих зернышек кармина и насасывают необходимое количество жидкости.

Полученная таким образом взвесь содержит однородные по размеру частицы кармина диаметром 2—4 микрона. Содержимое пипетки переносят в чашечку или пробирку и разбавляют в 20 раз. После этого в пробирку для фагоцитоза (такого же образца, как и в опыте с фагоцитозом микробов) отмеривают 0,6 мл приготовленной взвеси кармина и сюда же затем прибавляют пипеткой от гемометра 20 мм³ исследуемой крови. Содержимое пробирки перемешивают, укрепляют в держалку моторчика Уоррена, расположенного в термостате, и оставляют при температуре 37° на 1,5 ч.

По истечении этого срока пробирки вынимают из термостата, прибавляют каплю 1%-го раствора осмиевой кислоты, центрифугируют и из осевших кровяных телец делают мазок, как было описано выше.

После того как мазок подсохнет, его фиксируют 3 мин в метиловом спирте, а затем окрашивают 1%-м водным раствором метиленовой синьки в течение 30 с. Чтобы смыть лишнюю краску, мазок опускают на короткое время в водопроводную воду и высушивают, промакнув фильтровальной бумагой.

При рассматривании мазка под микроскопом хорошо видны окрашенные в голубой цвет лейкоциты и на голубоватом фоне их протоплазмы резко выделяются буровато-красные зернышки и глыбки кармина. Эритроциты при этом почти не окрашиваются.

Фагоцитированные зернышки кармина подсчитывают таким же способом, как и при фагоцитозе микробов.

 

Библиография

1. Бауер О.Н. Взаимоотношения между паразитами и хозяевами (рыбами)//Основные проблемы паразитологии рыб.-Л.,1958.-С.90-108.

2. Беспалый И.И. Жаберная гниль карпа и меры борьбы с ней.-Киев: Изд-во АН УССР, 1950.-42 с.

3. Возный Н.Е., Ивасик В.М. Некоторые морфологические и биохимические показатели крови карпов и сазано-карповых гибридов при инвазии паразитами//Вестник зоологии.- 1974.-С.40-45.

4. Головин Н.П., Головина Н.А. Некоторые вопросы цитогенеза при газопузырьковой болезни// Материалы 2-й регион. конф. по паразитам и болезням рыб и мерам борьбы с ними в Казахстане и республиках Средней Азии.-Алма-Ата,1977.-С.68-69.

5. Головина Н.А. К морфологии белой крови двухлетних карпов// Тр. ВНИИПРХ.-1976.- Т.26.-С.48-53.

6. Головина Н.А., Поддубная А.П., Манкирова В.Б. Влияние некоторых заболеваний на гематологические показатели// Вестник зоологии.-1977.- №5.-С29-33.

7. Заварзин А.А., Щелкунов С.С. Руководство по гистологии.-М.: Медгиз,1954.-698 с.

8. Иванова Н.Т. Атлас клеток крови рыб (сравнительная морфология и классификация форменных элементов крови рыб).-М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982.-184 с.

9. Канаев А.И. Кариофиллоз карпа: Автореферат дисс… канд.биол.наук.-М., 1956.-16 с.

10. Капустина Н.И. О паразито-хозяиных отношениях в системе Khawia sinensis – карп при невысоких интенсивностях инвазии //Тр.ВНИИПРХ.-1978.-Т.27.-С.75-87.

11. Кудрявцев А.А., Кудрявцева Л.А., Привольньев Т.И. Гематология животных и рыб.- М.,Колос.-1969.-320 с.

12. Маргаритов И. Исследования на някон хематологични показатели на двухлетен шаран болен от бранхионкроза//Рибностопанство.-1973.-№2.-С.5-8.

13. Метелев Б.В. Картина крови карпа при гнойно-некротическом воспалении плавательного пузыря//Тез. докл.IV Всесоюз. совещ. по болезням рыб.-Л., 1963.-С.67-69.

14. Наумов И.П., Корташев И.Ю. Зоология позвоночных.-М.:Высш. шк.,1979.-381 с.

15. Остроумова И.Н. Показатель крови и кроветворение в онтогенезе рыб//Изв.ГосНИОРХ.- 1957.- Т.43, №3.-С.69.

16. Пищенко Е.В., Ефанова Н.В., Бакшеев А.Ф. Характеристика лейкоцитов у двухлетков алтайского зеркального карпа седьмого поколения селекции //Состояние водных экосистем Сибири.-Томск, Томский гос. ун-т, 1998, - С.239-240.

17. Решетникова А.В. Об изменении крови сазана при заражении ихтиофтириусом//Науч.- техн. бюл./ ГосНИОРХ.-1962.- №15.-С.71-73.

18. Садовская О.Д. Изменение лейкоцитарной формулы карпа при инвазии// Работы по гельминтологии к 80-летию акад. И.И.Скрябина.-М.,1967.-С.320-321.

19. Суворов Е.К. Основы ихтиологии.-М.,Советская наука,1948. - 557 с.

20. Терентьева Э.И., Шишканова З.Г. Атлас ультраструктуры клеток кроветворной ткани.- М.:Медгиз.- 1972.-134 с.

21. Тодоров Иордан. Клинические лабораторные исследования в педиатрии.-София.: Медицина и физкультура,1959.-553 с.

22. Турдыев А.А. Ультраструктура гранулоцитов карповых рыб// Архив анатомии, гистологии, эмбриологии.-1975.-№2(19),т.58.-С.75-79.

23. Черникова В.В. Гематологическая характеристика зимующего сеголетка карпа/ Изв. ГосНИОРХ.- 1974.-Т.88.- С.109-135.

24. Чечина А.С., Буянова М.Н. К вопросу о изучении так называемого воспаления плавательного пузыря//Тез. докл. XII науч. конф. по изучению внутр. водоемов Прибалтики.-Вильнюс,1968.- С.70-72.

25. Шмальгаузен И.И. Основы сравнительной анатомии.-М.: Советская наука,1947.-539 с.

26. Шмидт Г.А. Эмбриология позвоночных.-М.:Советская наука,-1953.-403 с.

27. Шполянская А.Ю. Воспаление плавательного пузыря у сеголетков и годовиков карпа//Сб.докл. преп. с.-х. вузов РСФСР по пруд. рыб.-М.,1964.-С.111-115.

28. Deansley R. The structure and development of the thymus in fish, with special reference to Salmo farrio//Q.JI. microsc.Sci.71,1927.-P.113-145.

29. Ellis A.E. The leukocytes of fish// J.Fish.Biol.-1977.-P.453-491.

30. Gottlieb A.A., Woldman S.R. The multiple function of macrophages in immunity// Macrophages and Cellular immunity/London.: Butterworths,-1972.- P.13-44.

31. Turpen J.B., Volve E.P., Cohen N. Ontogeny and perioxid of thimiclimphocytes//Since.-1972.-

№182.-P.931-933.

СОДЕРЖАНИЕ

I. КРОВЬ, ЕЁ СОСТАВ И ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИИ................................. 5

Морфология системы крови............................................................................ 5

Гемопоэз и классификация форменных элементов крови рыб................... 8

Клеточные элементы зернистого ряда......................................................... 11

Клеточные элементы лимфоидного ряда.......................... 13

Клеточные элементы моноцитоидного ряда............................................... 15

Клеточные элементы эритроидного ряда.................................................... 15

Клеточные элементы тромбоцитоидного ряда........................................... 16

Морфология клеток крови карпа Cyprinus carpio (L.)................................. 17

в норме и при заболеваниях.......................................................................... 17

Состав и морфология клеток крови у здорового карпа.............................. 17

Морфологическая характеристика клеток белой крови карпа................. 19

Патологические структурные изменения в клетках крови...................... 21

Сапролегниоз икры карпа................................................. 22

Бранхиомикоз двухлетков карпа....................................... 22

Воспаление плавательного пузыря (ВПП)........................ 23

Ихтиофтириоз сеголетков карпа....................................... 24

Хилодонеллез сеголетков карпа........................................ 24

Дактилогироз карпа........................................................... 25

Кавиоз сеголетков карпа.................................................... 25

Газопузырьковая болезнь карпа....................................... 26

II. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ КРОВИ РЫБ.................................... 26

1.Оборудование.............................................................................................. 26

2.Взятие крови................................................................................................ 27

3. Подсчет красных и белых кровяных телец............................................. 30

4. Изготовление мазков, фиксация, окраска препаратов........................... 34

5.Техника микроскопирования..................................................................... 37

6.Подсчет соотношения отдельных видов лейкоцитов крови (лейкоцитарная формула)........................................................................... 37

7. Определение количества гемоглобина.................................................... 38

8.Определение стойкости эритроцитов к гипотоническим растворам

(гемолиз).......................................................................................................... 39

9.Определение скорости оседания эритроцитов (соэ)............................... 40

10. Определение фагоцитарной способности лейкоцитов крови............. 42

Библиография................................................................................................. 45

Пищенко Елена Витальевна Гематология пресноводной рыбы Учебное пособие

 

Редактор Н.К. Крупина Компьютерная верстка Пищенко Е.В.

 

Подписано в печать.............. 2002 г.

Формат 60х84 1/16. Объем 2,9 уч.-изд.л. Тираж 100 экз. Изд №96. Заказ №

 

Отпечатано в ИЗОП

630039. Новосибирск, ул. Добролюбова, 160.