Изготовление мазков, фиксация, окраска препаратов

Изготовление мазков. Для изготовления тонкого мазка крови на край предметного стекла наносят небольшую каплю крови, перед которой ставится под углом 45° другое отшлифованное стекло, которое отодвигают назад до соединения с каплей крови так, чтобы она растеклась между краем шлифованного и поверхностью предметного стекла. Затем медленным движением производят мазок. Чтобы он был равномерным, большой и указательный пальцы, скользя по краям предметного стекла, должны слегка опираться на них. При таком положении рука достигает достаточной устойчивости и мазок получается равномерным. Считают, что при правильном изготовлении препарата (рис.

6) мазок должен заканчиваться, не достигая 1,5-2,0 см до края стекла.

 

Рис. 6. Получение мазка крови.

 

Изготовление отпечатков органов, исследуемых на кроветворную функцию. Для получения отпечатков органов, исследуемых на гемопоэз, берут небольшое количество ткани из разных частей исследуемого органа. Перед изготовлением препарата кусочек почки или другого кроветворного органа, осушают с помощью фильтровальной бумаги, марлевой салфетки или бинта. Затем орган по линии разреза легко и осторожно многократно прикладывают к предметному стеклу. Из жаберных лепестков сначала производят соскоб скальпелем, а затем делают мазок. При этом надо помнить, что только на тонких мазках можно хорошо видны все морфологические особенности клеток. На толстых препаратах форменные элементы крови высыхают медленно и поэтому деформируются, а следовательно, и трудно поддаются определению. Чаще всего на толстом мазке ничего нельзя разобрать. Только на тонком препарате можно хорошо рассмотреть все морфологические особенности форменных элементов крови. Для любого вида морфологического исследования от каждого органа следует брать не менее 2-3 мазков или отпечатков органов гемопоэза. На каждом препарате с обратной стороны специальным карандашом по стеклу отмечают порядковый номер, название органа, дату. Длину тела рыбы, массу и другие данные заносят в полевой журнал.

Фиксация препаратов. Подписанные мазки крови и отпечатки органов, исследуемых на кроветворную функцию, ставят в специальные штативы для просушки, после чего производят фиксацию и окраску препаратов. В качестве фиксаторов используют жидкости типа Май-Грюнвальд, Лейшман, этиловый и метиловый спирт и др. Хорошо просушенные препараты попарно мазками наружу ставят на узкое ребро стекла в небольшой прямоугольный, иногда в округлый сосуд или специальные стаканчики и заливают готовым не разведенным фиксатором. Через 3-5 мин препараты освобождают от фиксатора и споласкивают дистиллированной водой. После этой операции докрашивают азурэозином по Романовскому - Гимза. При массовой окраске препаратов используют большие кюветы.

Окраска препаратов. Окраску, как и фиксацию препаратов следует проводить сразу после изготовления и просушки мазка. Готовый краситель азур-эозин, по Романовскому, предварительно разбавляют дистиллированной водой из расчета одна капля красителя на 1 мл дистиллированной воды. Время окраски 20-30 мин. После окраски препараты хорошо прополаскивают сначала дистиллированной, а затем простой водой и снова ставят в штативы для просушки. Рабочий раствор красителя готовят непосредственно перед употреблением. Для выявления зернистости на ранних стадиях развития гранулоцитов пользуются особой окраской - пероксидазной реакцией, по методу Сато и Секиа или по Грехему и Кнолю. В последнем случае лимфоциты не окрашиваются. Моноциты дают слабую положительную реакцию. С помощью этой реакции отличают молодые формы гранулоцитов от молодых форм лимфоцитов, а также взрослых лейкоцитов. В качестве фиксатора при этой реакции служит раствор, состоящий из одной части 40%-го раствора формалина и 9 частей 95° спирта- ректификата.

Реактив состоит из 2,1 мл 40%-го раствора этилового спирта с добавлением 2,9 мл воды и 0,02 мл 3%-го раствора перекиси водорода и нескольких крупинок бензидина до получения желтого цвета (в случае помутнения реактива при хранении в него добавляют 0,1 мл спирта). Время, необходимое для фиксации, 5 мин. По истечении указанного времени препарат освобождают от фиксатора и помещают в реактив, чаще всего реактив наливают прямо на препарат в количестве 1-2 капель. Через 4-6 мин мазки, докрашивают жидкостью Лейшмана [8].

Готовые сухие препараты перекладывают бумагой каждый в отдельности. При длительном хранении их складывают на ребра в специально приготовленные коробки, так как в таком виде их лучше и безопаснее транспортировать. Хранят препараты в темном месте. При этом надо помнить, что они не только бьются, но и могут прийти в негодность и при резкой смене температур. Поэтому при перенесении материала с холода в тепло не надо спешить с распаковкой, в противном случае пары воды будут осаждаться на стекло и произойдет гемолиз клеток. Следует помнить, что при окраске препаратов как крови, так и органов гемопоэза большое значение имеет качество воды. Хорошо окрашенные мазки и отпечатки получаются только в том случае, когда реакция воды будет нейтральной или слабощелочной. Реакцию воды определяют с помощью кристаллов гематоксилина. Для этого наливают в обыкновенную пробирку не более 10 мл воды и бросают в нее 1-2 кристаллика гематоксилина. Немедленное окрашивание воды в розовый цвет указывает на ее щелочность. Если вода окрасится позже чем через 5 мин, реакция ее кислая. В том случае, если после опускания кристаллика гематоксилина вода начнет окрашиваться не раньше чем через 1 мин и не позже чем через 5 мин, она пригодна для работы. Если реакция воды кислая, её можно нейтрализовать 1%-м раствором питьевой соды, прибавляя жидкость по каплям сначала к небольшому объему воды, а затем расход содового раствора переводится на весь запас. Нейтрализуют воду под контролем гематоксилина. При щелочной реакции вода принимает оранжевый оттенок, при слабокислой - рубиновый. Для нейтрализации воды часто пользуются жидкостями состоящими из буферных фосфатов. Подробная таблица расчет соотношений смеси растворов фосфатов для нейтрализации воды приведена в книге А.А. Кудрявцева и др. (1969).

 

ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ

Микроскопируют окрашенные препараты под обыкновенным световым микроскопом МБИ-1, МБИ-2 и др. с применением иммерсионного объектива. Наибольшая четкость изображения достигается при использовании окуляра х7, а разрешающая способность увеличивается с применением окуляра х15 и более. Удобен при камеральной обработке гематологического материала большой биологический бинокулярный микроскоп с наклонным тубусом. Исследуют мазки при дневном свете с применением плоского зеркала или и использованием электрической подсветки с светофильтром. Вогнутым зеркалом пользуются при искусственном освещении (рекомендуется при микрофотографии и другой микроскопии с большими увеличениями). Осветителями служат ОИ-24 и ОИ-Ти др. Микрофотографирование производят с помощью микрофотонасадок различных конструкций: МФН-1, МФН-12 и др., а также с помощью специального микроскопа с вмонтированным в него фотоаппаратом (модель "Ультрафот" Цейса) и др. Нужные зарисовки делают с помощью рисовального аппарата, который прикрепляют к верхней части тубуса микроскопа. Благодаря наличию особой кубической линзы, состоящей из двух прямоугольных линз, склеенных особым образом, видимое исследователем изображение сбрасывается на бумагу, расположенную на рабочем столе рядом с микроскопом, или же на особую подставку, покрытую бумагой. При таком положении увеличенные контуры изучаемого предмета можно довольно точно обвести карандашом. Для установления правильного соотношения освещенности бумага и аппарата служат сменные светофильтры, заключенные в барабане рисовального аппарата. Из других приспособлений к обыкновенному световому микроскопу удобно поставить окуляр с указательной стрелкой. Можно рекомендовать бинокулярную насадку, фазово-контрастное устройство и др.

 

 

ПОДСЧЕТ   СООТНОШЕНИЯ                       ОТДЕЛЬНЫХ          ВИДОВ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ (ЛЕЙКОЦИТАРНАЯ ФОРМУЛА)

Техника подсчета лейкоцитарной формулы заключается к приготовлении мазка крови, его окраске и подсчете различных форм лейкоцитов в мазке. Мазок делают на тщательно вымытом и обезжиренном (путем погружения в смесь спирта с эфиром) предметном стекле. Чтобы сделать мазок, берут в правую руку чистое покровное стеклышко, касаются одним краем капли крови и, затем, наклонив его на 45°, приводят в соприкосновение с предметным стеклом. Капля крови растекается в силу капиллярности по краю покровного стекла. После этого покровное стекло ведут вдоль предметного. Необходимо, чтобы капля крови тянулась за покровным стеклом, а не находилась впереди его. Мазок не должен быть ни слишком тонок, ни слишком толст.

После того как мазок подсохнет, его фиксируют, опуская на 3 минуты в метиловый спирт. Осушив мазок от спирта, его окрашивают.

Для окраски препаратов краску Романовского разводят дистиллированной водой из расчета 1—2 капли краски на 1 мл воды. Вода должна иметь рН7. Для этой цели к дистиллированной воде добавляют фосфатный буфер. Краску разводят непосредственно перед окраской. Затем разведенную краску берут пипеткой и покрывают ею зафиксированный мазок. В зависимости от температуры воздуха и от качества краски мазок окрашивают от 2 до 40 мин. После этого краску сливают, мазок промывают водопроводной водой и высушивают, осторожно промокая фильтровальной бумагой.

Мазок рассматривают под микроскопом с иммерсией. Для получения правильных результатов подсчет ведут по краям мазка зигзагообразно (от края мазка вглубь на три-четыре поля зрения и обратно).

Всего подсчитывают 200 лейкоцитов, по 50 шт. на четырех краях мазка.

Все обнаруженные формы лейкоцитов записывают в таблицу, а затем суммируют в отдельности по формам. Для удобства записи и последующего расчета встречающиеся формы лейкоцитов отмечают в специальной таблице, составленной по следующему образцу.

Каждый раз встречая в мазке какую-нибудь форму лейкоцита, отмечают её в соответствующей строке палочкой. Записав 10 лейкоцитов в вертикальной графе, начинают запись в следующей вертикальной графе. Верхняя цифра в вертикальной графе показывает сумму подсчитанных лейкоцитов. После того как все 12 вертикальных граф будут заполнены, подсчитывают количество отдельных лейкоцитов каждой формы и определяем их соотношение в процентах.