Подсчет красных и белых кровяных телец

Для подсчета форменных элементов требуются счетная камера, смеситель для разбавления крови (или же пробирки с градуированными пипетками), специальная игла для взятия крови, растворы для ее разбавления и спирт с ваткой для обеззараживания кожи.

Счетная камера состоит из толстого предметного стекла, на котором в середине приклеены три стеклянные пластинки. Средняя пластинка ниже боковых на 0,1 мм. Если на пластинки положить шлифованное покровное стеклышко, то между ним и средней пластинкой образуется пространство высотой 0,1 мм.

На поверхность средней пластинки нанесена тонкая сетка, которую можно видеть под микроскопом. Сетка составлена из мелких и более крупных квадратиков. Каждая сторона мелких квадратиков равняется 0,1 мм и, следовательно, площадь составляет ¹/₄₀₀ мм². Площадь больших квадратиков, предназначенных для подсчета белых кровяных телец, составляет ¹/₂₅ мм². Есть несколько видов счетных камер, которые различаются расположением на сетке больших и малых квадратов (рис.4). Площадь же маленьких и больших квадратов везде остается одинаковой.

В камере Тома каждый пятый ряд мелких квадратиков имеет дополнительную линию, проходящую по его середине. Благодаря этому каждые 16 маленьких квадратиков образуют как бы большой квадрат, площадь которого равна 1/20 х 1,20 == 400 мм². Сетка в камере Тюрка, кроме того, по углам имеет еще большие квадраты. В камере с сеткой Горяева мелкие и большие квадраты расположены отдельно на всем протяжении сетки, что гарантирует меньшую ошибку при подсчетах. Ошибка может происходить из-за неравномерного распределения кровяных телец в разных участках сетки.

Рис. 4 Камеры для подсчета клеток крови: а) Тома: l— большой квадрат, 2 - малый квадрат; б) Тюрка: Е - большие квадраты: в) Бюркера: 1—большой квадрат, 2 — малый квадрат; г) Горяева.

 

 

Если под покровное стекло ввести каплю жидкости, то она в силу капиллярности распределится по пространству между покровным стеклом и средней пластинкой, имеющей сетку.

 

 

Рис. 5 Прибор для подсчета                                                          форменных элементов: Л — смеситель: М — резиновая трубка; а—счетная камера сверху; с, d —стеклянные пластинки, е— покровное стекло, D— картина наполнённой камеры под микроскопом

 

Рассматривая под микроскопом сетку, мы видим жидкость как бы разделенной на кубики высотой ¹/₁₀ мм и площадью ¹/₄₀₀ или ¹/₂₅ мм²; следовательно, объем их будет равен ¹/₄₀₀₀ или ¹/₂₅₀ мм³.

Перед подсчетом в камере кровь должна быть разбавлена, иначе кровяные тельца располагаются настолько густо, что подсчитать их невозможно. Для подсчета эритроцитов обычно кровь взятую у рыб разбавляют в 200 (или 100), а для подсчета лейкоцитов в 10-20 раз специально приготовленными красителями. Разбавление проводят в смесителе для кровяных телец - меланжере (рис. 5), который представляет собой капиллярную трубочку с отметками, расширяющуюся далее в ампулу. Внутри расширенной части для облегчения смешивания имеется стеклянный шарик. Далее ампула вновь суживается в капилляр, на котором нанесена отметка. На этот конец смесителя для удобства насасывания крови и разбавляющего раствора надевают резиновую трубочку.

При подсчете количества лейкоцитов млекопитающих кровь разбавляют раствором уксусной кислоты, но этот способ не применим для определения количества лейкоцитов в крови рыб, так как ядра эритроцитов не растворяются в нем и затрудняют подсчет в камере, поэтому пользуются методом прижизненной - витальной окраски клеток крови. При этом отпадает необходимость разбавления эритроцитов и лейкоцитов в различных смесителях, красные и белые кровяные тельца могут быть подсчитаны в одной камере.

Для витальной окраски форменных элементов крови рыб применяют два раствора:

Раствор А:

Нейтральрот.	25 мг
Хлористый натрий	0,6 г
Дистиллированная вода	100 мл

Раствор В:

Кристалл-виолет	12 мг
Лимоннокислый натрий	3,8 г
Формалин	0,4 мл
Дистилированная вода	100 мл

Растворы готовятся ex tempore, для лучшей растворимости каждый следующий компонент раствора добавляют после растворения предыдущего. Эти растворы нестойки. Раствором А можно пользоваться только одни сутки. Раствор В может храниться около недели.

Для разбавления крови применяют смеситель (меленжер), позволяющий разбавлять кровь в 100 раз. Кровь набирают до отметки 1,0. После этого в смеситель набирают раствор А до половины расширения смесителя (приблизительно), а затем кончик смесителя переносят в чашечку с раствором В и наполняют смеситель до отметки 101. После этого смесителю придают горизонтальное положение и вращают пальцами для перемешивания крови. Перемешивание нужно проводить в течение 1¹/₂—2 мин. После перемешивания крови с красками оставляют смеситель на 5—10 мин в покое, вновь перемешивают и затем, стряхнув, как обычно, первые 2—3 капли из смесителя, следующую каплю вносят в счетную камеру.

Кроме меланжерного способа, можно разводить кровь в пробирках. Пробирочный способ как более надежный был предложен Н.М.Николаевым. При этом способе меланжеры заменяются микропипетками и серологическими пробирками. Для забора крови используются микропипетки от гемометра Сали градуированные на 20 мкл. Кроме того, нужны 2 химические микропипетки объемом 2 мл.

Для разбавления крови в 200 раз заранее подготовленные серологические пробирки заливают 2 мл раствора А. В тот же раствор заливают кровь из пипетки гемометра, тщательно перемешав содержимое пробирки, добавляют в нее 1,98 мл раствора Б.

Для подсчета количества красных и белых кровяных телец у рыб лучше всего брать кровь из хвостовой артерии.

После разведения крови в 200 (или 100) раз подсчитывают форменные элементы.

Покровное стекло на пластинки счетной камеры следует наложить заранее; оно должно прилегать к боковым пластинкам как можно плотнее. В этом можно убедиться по появлению радужных полосок (ньютоновых колец). Если подвести каплю к покровному стеклу в том месте, где имеется пространство между ним и средней пластинкой, капля смеси заполнит пространство в силу капиллярности.

Эритроциты и лейкоциты, имеющиеся в смеси, спустя несколько минут осядут на дно сетки.

Далее счетную камеру ставят под микроскоп, находят сетку и подсчитывают эритроциты в каждом малом квадратике. В эритроцитах слабо окрашены только ядра. Ядра лейкоцитов окрашиваются в темный фиолетово-красный цвет, а протоплазма их - в розоватый цвет. Благодаря этому эритроциты и лейкоциты в камере легко отличимы.

Тельца, расположенные на линиях квадратика, подсчитывают так: эритроциты, лежащие на верхней и левой линии, причисляют к общему количеству; эритроциты, лежащие на правой и нижней линии квадратика, не считают, так как их подсчитывают в соседних квадратиках. Всего просматривают 80 малых квадратиков, суммируют просчитанные клетки, получают среднюю и умножают на разведение (100 или 200) и на 4000.

Лейкоциты подсчитывают в той же счетной камере, что и эритроциты, но не в малых, а в больших квадратах. Площадь этих квадратов, как уже указывалось, равна ¹/₂₅ мм². Подсчитывают 5—6 квадратов. Полученное среднее число умножают на 250 и на разведение.