Способы получения отдельных генов

Необходимые научные и технические предпосылки для бурного развития генетической инженерии были созданы в 70-х годах ХХ века. При этом манипуляцию с геномами исследователи начали значительно раньше – в первой половине прошлого века (напр., Дж.Гёрдон). Различают термины – генетическая и генная инженерия.

В организме человека функционирует примерно 20 тысяч генов, для выделения которых можно воспользоваться рядом известных методов.

Известны 3 основных способа получения генов: непосредственное выделение из природного материала;получение так называемых кДНК путем копирования иРНК – синтез одноцепочечных ДНК, с последующим образованием второй цепи; химический синтез. Важнейшими инструментами генной инженерии являются специфические ферменты – эндонуклеазы, способные расщеплять молекулы ДНК в строго определённых местах (последовательностях).Их называют рестриктазами. Открыто более 400 типов рестриктаз.

Рестриктаза EcoRI: выделена из кишечной палочки – Escherichia (первая буква названия фермента) coli (две другие буквы названия). Каждый такой фермент узнаёт определённую 4-7-членную последовательность нуклеотидов в структуре ДНК; При расщеплении ДНК какой-либо одной рестриктазой получают смесь фрагментов, каждый из которых имеет одни и те же концевые участки. Использование тотальной ДНК организма и «мелкощепящей» рестриктазы позволяют получить популяцию больших фрагментов ДНК, содержащих полноразмерные гены. В результате получается геномная библиотека. Причины создания технологии кДНК: Избыточность генома эукариот, Наличие многочисленных повторяющихся «молчащих» последовательностей, Методические сложности.

Геномные библиотеки кДНК: Представляют собой популяции иРНК в отдельных тканях. Следовательно, здесь мы имеем дело только с функционально активными генами. Удвоение кДНК приводит к формированию устойчивой двухцепочечной структуры ДНК, который является по сути отдельным геном

 

ПОНЯТИЕ ВЕКТОРА

Научились создавать специальную систему в виде вектора, представляющего собой циклическую ДНК, содержащую сигналы репликации и транскрипции. В качестве векторов для клонирования используют бактериальные плазмиды,фаги или космиды, в которые встраивают полученный ген. Для этого кольцевую плазмидную ДНК разрезают специфической рестриктазой. В результате могут образоваться «тупые» (одинаковые по длине) или "липкие" (разные по длине) концы. Для реакции нужны «липкие» концы, которые можно сформировать с помощью химических реакций.

Инкубация с синтезированным геном приводит к созданию химерной плазмиды, способной заставить работать встроенный ген. Далее ведут отбор клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК, по способности расти в присутствии антибиотика. Таким образом, библиотека кДНК - набор векторов. Процесс многократного копирования химерных векторов - клонирование, а полученные копии – клона ДНК. Происходит в бактериальных клетках. Клонирование для: Исследования его физико-химических и генетических свойств, Использования в качестве инструмента (зонда) при выделении индивидуальных генов из других организмов, Создания генетически изменённых организмов, полезных для человека,Лечения заболеваний. Вводят чужеродные агенты с помощью: трансформации, трансфекции, инфекции вирусом или бактериофагом, слияния протопластов, с использованием липосом,микроинъекций в клетку или ядро. Трансформация включает введение в бактериальную клетку очищенной чужеродной ДНК, несущей необходимый ген, с её последующей интеграцией с хромосомой ДНК клетки-реципиента. ПРОБЛЕМЫ ЭКСПРЕССИИ КЛОНИРОВАННЫХ ГЕНОВ. Изменение структуры наследственного материала реципиентной клетки, содержащей чужеродные гены, не всегда сопровождается изменением её фенотипа. Результат генетической трансформации клетки зависит от возможностей экспрессии введенного в неё гена.

Проблемы экспрессии чужих генов: значительные различия первичной структуры промоторных участков генов про- и эукариот;наличие в генах эукариот не транслируемых вставок, что удается преодолеть синтезом кДНК с исходной иРНК;недостаточная стабильность чужой иРНК в клетке;ускоренный протеолиз чужеродных белков, что делает необходимым создание механизма их экскреции из клеток и накопления во внешней среде;отсутствие специфической посттрансляционной модификации белков.

ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ

Методические разработки по выделению клеток, созданию культур клеток растений, регенерации целых организмов из клеток или протопластов дали много ценной информации в понимании процессов роста и развития организмов. Традиционные методы селекции и слияния протопластов тоже можно рассматривать как своеобразную генетическую инженерию, манипулирующую наследственным материалом. Методы создания трансгенных растений: использование Agrobacteria, использование ДНК-пушки (нанесение ДНК на металлические частицы и обстрел этими частицами растительной клетки, встраивание ДНК в клетку. Особенности генной инженерии растений состоят в наличии природного генного вектора, возникшего в процессе эволюции почвенных бактерий. В группе Agrobacteria есть несколько видов, способных заражать и вызывать образование наростов (недифференцированной опухолевой ткани) у большинства двудольных растений. Ti-плазмида Представлена кольцевой молекулой ДНК с молекулярной массой примерно 1,2 х 10 ⁸ (3-5% от размера хромосомы бактерии). Она частично интегрируется с хромосомами клетки растения. При инфекции трансформирующий участок ДНК плазмиды встраивается в разные точки хромосом хозяина, Это приводит к изменению фенотипа клеток (образованию недифференцированной ткани) и изменению ее метаболизма, Этот участок Ti-плазмиды никогда не интегрируется с ДНК хлоропластов или митохондрий. Другой системой для создания векторов являются мобильные элементы генома кукурузы: инсерционные последовательности (IS-элементы) или более сложные образования – транспозоны. Основные принципы их модификации остаются прежними.