Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг

В работе были использованы крысы линии Крушинского-Молодкиной (КМ), генетически предрасположенных к аудиогенной судорожной активности. Они были разделены на две группы. Первая группа это крысы, не подвергавшиеся звуковому воздействию (n=10). Вторая - крысы, которым давались периодические кратковременные (до 90 сек.) предъявления звукового стимула (1 раз в день) в течение 40 дней (аудиогенный киндлинг) (n=4).

В опытах с хронической звуковой стимуляцией использовались самцы крыс линии КМ массой 200-250 граммов, которые содержались в условиях вивария при постоянных температурных условиях и продолжительности светового периода 12 часов. Предварительно, животные тестировались по продолжительности и интенсивности аудиогенной судорожной реакции в ответ на действие звука (115 дБ, 12-16 кГц, 90 сек.) по 4-х бальной шкале (Батуев и др., 1997).

1 балл - двигательное возбуждение, бег, прыжки

2 балла - двигательное возбуждение заканчивается внезапным ступорозным состоянием с падением животного на брюшко.

3 балла – 2 балла + падение животного на бок с резкими клоническими судорогами.

4 балла – 3 балла + тоническое напряжение всей мускулатуры и временная остановка дыхания.

Хроническая стимуляция, проводимая в течение 21 дня звуковыми стимулами интенсивностью 75 дБ до начала двигательного возбуждения (но не более 90 секунд), приводила к постепенному увеличению продолжительности и интенсивности аудиогенной судорожной реакции от реакции в 2,5 ± 0,4 бала с латентным периодом 5-7 сек. к реакции в 3,5 ± 0,6 балла с латентным периодом 2-5 сек., включающей миоклонические гиперкинезы. Дальнейшее продолжение ежедневной стимуляции до 40 дней усиливало выраженность этих реакций. Использование более длительной стимуляции не приводило к дальнейшим изменениям. Поэтому через 40 дней звуковые стимулы прекращались. Полученное состояние сохранялось, по крайней мере, в течение одной недели без предъявления звука. После этого животных декапитировали и выделяли срезы гиппокампа для последующего анализа.

 

Использованные вещества

Вещества для приготовления рабочих растворов были приобретены в фирме Sigma (Dorset, Великобритания), специфические агонисты, антагонисты и модуляторы рецепторов в Tocris Cookson LTD (Bristol, Великобритания), QX314Br в TCS Biologycals (Buckinghamshire, Великобритания), тетродотоксин в Latoxan (Valence, Франция). Рабочий раствор Рингера и раствор для резки срезов готовился на основе бидистиллированной или деионизованной воды перед каждым экспериментом из маточного раствора, содержащего все компоненты кроме глюкозы и CaCl₂, которые добавлялись в последнюю очередь. Агонисты и антагонисты готовились в объеме необходимом для проведения нескольких экспериментов и замораживались в эппендорфах. В качестве растворителя использовалась деионизированная вода, DMSO или эквимолярная концентрация NaOH (NaOH э.м.). В качестве маточного раствора пентобарбитала использовался раствор, применяемый при эфтаназии (60 мг/мл). Раствор тетродотоксина готовился при введении с помощью шприца в запаянный флакон растворителя (слабого раствора уксусной кислоты) в необходимом объеме. Использованные в работе вещества и их концентрации приведены в таблице 2.1

 

 

Таблица 2.1 Использованные вещества

Вещество	Эффект	Концентр.	Раствори- тель	Мол. масса	Примечание
(-)-бикукуллина метобромид	Антагонист ГАМКА рецепторов	10 μМ	вода	471.31	Возможны эффекты не только на ГАМК рецепторы
CACA	Агонист ГАМКС рецепторов	200 мM	вода	101.11	Ионтофорез (агонист растворялся в физ. растворе)
CGP 52432	ГАМКB антагонист	5 μМ	вода
CNQX	Антагонист каинатных и AMPA рецепторов	50 μМ	вода	307.64	Может дествовать на NMDA рецепторы
Дегидрокаинат (DHK)	Блокатор uptake глутамата	200 μМ	NaOH э.м.
DL-APV	Антагонист NMDA рецепторов	50 μМ	NaOH э.м.
ГАМК	Агонист ГАМК рецепторов	200 мМ	вода	103.12	Ионтофорез (агонист растворялся в физ. растворе)
GYKI 53655	Антагонист AMPA рецепторов	50 μМ	DMSO	361.4
Изокувазина гидрохлорид	Специфический агонист ГАМКА рецепторов	100 мМ	вода	163.6	Ионтофорез (агонист растворялся в физ. растворе)
каинат	Агонист каинатных и AMPA рецепторов	250 нМ, 1 μМ	NaOH э.м.	235.75	Может влиять на uptake гутамата
L-AP4*H2O	Агонист mGluRIII	50 μМ	NaOH э.м.
MSOP*2^1/4 H2O	Антагонист mGluRIII	100 μМ	NaOH э.м.
NBQX*H2O	Антагонист каинатных и AMPA рецепторов	25 μМ	вода
Пентобарбитал	Модулятор ГАМК рецепторов	100 μМ	готовый раствор	226.3	Разведение готового растворя для инъекций 60 мг/мл
Пикротоксин (PTX)	Антагонист ГАМК рецепторов	0,1 - 1000 μМ	DMSO	602.6	Смесь 1:1 пикротоксинина и пикротина
SCH 50911	Антагонист ГАМКB	20 μМ	вода	175.01
SKF 89976A	Блокатор uptake ГАМК	25 μМ	вода	371.9	Основной эффект на GAT1 - транспортер
SR 95531 (габазин)	Специфический Антагонист ГАМКА	10 μМ	вода	368.23
TACA	Агонист ионотропных ГАМК рецепторов	2,5 – 15 μМ	вода	101.11
THA	Блокатор uptake глутамата	300 μМ	NaOH э.м.
TPMPA	Антагонист ГАМКС рецепторов	200 μМ	вода	161.14	При высоких конц. блокирует и ГАМКА
Тетродотоксин (TTX)	Блокатор Na^+-каналов	2 μМ	раствор ацетата	319.28	Крайне токсичен

Статистический анализ

Экспериментальные данные каждой серии (n≥4) были усреднены и представлены в виде средняя ± стандартная ошибка средней. Достоверность различий данных оценивалась с использованием парного или непарного t‑теста и однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Различия считались достоверными при P<0,05. Аппроксимирующие кривые на графиках рассчитывались по методу наименьших квадратов.