Ионные каналы ионотропных ГАМКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках имеют различную проводимость

Мы исследовали свойства ГАМКергических рецепторов в изолированных outside-out пейчах, полученных с интернейронов и пирамидных нейронов. ГАМК (1 мМ) подавалась на пейчи с использованием системы быстрой аппликации (см. Материалы и методы раздел 2.5). Длительность каждой аппликации была 1 мс, что приблизительно соответствует концентрации нейропередатчика и длительности событий в гиппокампальных синапсах (Clements et al. 1992; Nusser et al. 2001). При использовании данного метода нам удавалось получить ГАМКергические токи с пейчей, амплитуда которых находилась в интервале от 50 до 300 пА. Такая вариабельность объясняется, по всей видимости, различным числом рецепторов в том участке мембраны, который служил для приготовления препарата. Мы не обнаружили значительных различий между интернейронами и пирамидными клетками в константе затухания полученных токов (Рис. 3.1.2; Таблица 3.1.1). Для оценки средней вероятности открытого состояния канала (P_отк) и проводимости одиночного канала ГАМКергических рецепторов мы воспользовались методом нестационарного

 

Рис. 3.1.2 Ионотропные ГАМКергические рецепторы в пирамидных клетках обладают более высокой средней проводимостью одиночного канала, чем в интернейронах

Токи, регистрируемые в ответ на быструю аппликацию ГАМК (1 мМ; 1 мс) на outside-out пейчи полученные с одного интернейрона (а ₁) и пирамидной клетки (б ₁). Тонкие линии показывают индивидуальные ответы, полученные в результате 20 последовательных аппликаций ГАМК, а жирные результат их усреднения. Под оригинальными токами показаны зависимости дисперсии тока (σ) от его амплитуды для интернейрона (а₂) и пирамидной клетки (б₂) полученные с тех же пейчей, что и ответы (а₁ и б₁). Линии аппроксимации получены по уравнению σ²=iI-I²/N_P (см. Материалы и методы). Статистические данные, полученные в результате использования нестационарного дисперсионного анализа, обобщены в таблице 3.1.1

 

Таблица 3.1.1 Биофизические свойства ГАМКергических рецепторов
	Интернейрон	(n)	Пирам. нейрон	(n)	p (t-тест)
i(ГАМК), пA	1,44 ± 0,12		2,1 ± 0,2		*0,01
S, пС	22,3 ± 1,9		32,5 ± 2,3		*0,01
Pотк	0,51 ± 0,11		0,47 ± 0,12		0,85
τзатух, мс	34 ± 4		31 ± 3		0,61

где, i – средний ток одиночного канала, S – средняя проводимость одиночного канала, P_отк – максимальная вероятность открытого состояния канала, τ_затух – константа затухания токов.

дисперсионного анализа (см. Материалы и методы раздел 2.5). При этом мы не обнаружили существенного различия в P_отк. Однако, проводимость одиночного канала была значительно ниже в пейчах, полученных с интернейронов, по сравнению с пейчами, полученными с пирамидных клеток. Эти данные указывают на различный субъединичный состав ГАМКергических рецепторов (или различную пропорцию субъединиц) в интернейронах и пирамидных нейронах.

3.1.3 Ионотропные ГАМКергические рецепторы как в интернейронах, так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту ГАМК_С рецепторов

Известно, что чувствительность к пикротоксину ГАМКергических рецепторов определяется наличием боковых цепочек аминокислот в сегменте M2, покрывающих внутреннюю часть канала, в частности, треонина разных субъединиц, находящегося в R⁶ положении (Xu and Akabas 1996; Zhang et al. 1995a; Zhang et al. 1995b; Zhorov and Bregestovski 2000). Среди субъединиц ГАМКергических рецепторов грызунов только ρ₂ имеют отличную аминокислоту в этом участке, что делает гомомерные и гетеромерные ρ₂-содержащие рецепторы относительно нечувствительными к пикротоксину (Greka et al. 1998; Zhang et al. 1995a). При этом, близкородственная ρ₁ субъединица содержит треонин в R⁶ положении и гомомерные рецепторы чувствительны к пикротоксину (Zhang et al. 2001). Возможно, в нашем исследовании сниженная чувствительность к пикротоксину связана с наличием в интернейрональном ГАМКергическом токе компонента, связанного с рецепторами содержащими ρ₂ субъединицу. В таком случае, пикротоксин нечувствительные токи должны фармакологически отличаться от пикротоксин чувствительных. Это связано с тем, что ρ-содержащие рецепторы (ГАМК_С) имеют ряд отличий по отношению к агонистам, антагонистам и аллостерическим модуляторам классических ГАМК_А рецепторов. Показано, что ГАМК_С рецепторы принимают участие в ГАМКергической передаче в ретине, спинном мозге и superior colliculus (Bormann 2000b; Zhang et al. 2001). Известно, что нативные ГАМК_C рецепторы в ретине также обладают сниженной чувствительностью к пикротоксину и низкой проводимостью одиночных каналов в сравнении с ГАМК_А рецепторами (Feigenspan et al. 1993). Однако, до настоящего времени не было показано роли ГАМК_С рецепторов в гиппокампе, не смотря на иммуноцитохимические данные, указывающие на наличие в нем РНК, кодирубщей ρ-субъединицы (Enz et al. 1995; Enz and Cutting 1999; Ogurusu et al. 1999; Wegelius et al. 1998).

В последнее время стали появляться доказательства того, что, по крайней мере, рекомбинантные ρ-субъединицы могут образовывать функциональные ГАМКергические рецепторы с γ₂ субъединицами (Pan et al. 2000; Qian and Ripps 1999). Эти данные указывают на теоретическую возможность определенных отклонений ГАМКергических токов в гиппокампе от фармакологического профиля токов, опосредованных классическими ГАМК_А рецепторами. Иммуноцитохимические исследования также показали, что плотность γ₂ субъединиц намного выше в интернейронах поля CA1, чем в пирамидных клетках (Sperk et al. 1997). Вместе взятые, эти данные указывают на то, что низкая чувствительность к пикротоксину в интернейронах, может объясняться комбинацией субъединиц ГАМКергических рецепторов, отличной от комбинации в классических ГАМК_А рецепторах.

Приняв во внимание сходство параметров ГАМКергических рецепторов интернейронов и ГАМК_С рецепторов (низкая чувствительность к пикротоксину и низкая проводимость одиночного канала), мы решили проверить на них эффект фармакологических агентов, специфичных для ГАМК_С рецепторов. Мы провели

ПК

 

 

Рис. 3.1.3 Генерализованная аппликация САСА (50 µМ) вызывает большие по амплитуде токи в пирамидных клетках, чем в интернейронах

а, Аппликация CACA (50 µМ), специфического агониста ГАМК_С рецепторов, производит увеличение тока компенсации в режиме фиксации потенциала как в интернейронах (), так и в пирамидных клетках (). Причем величина этого тока значительно выше в пирамидных клетках (ПК) - 153 ± 26 пА (n=5), чем в интернейронах (ИН) 55 ± 13 пА (n=4), p=0,02, t-тест (б).

 

аппликацию специфического агониста ГАМК_С рецепторов, цис‑аминокротоновой кислоты (CACA). Это вещество активирует рекомбинантные ГАМК_С рецепторы с K_d = 74 μМ и приблизительно в 130 раз менее эффективно для активации ГАМК_А рецепторов (Kusama et al. 1993). Необычным оказалось то, что аппликация низкой концентрации CACA (50 μМ, без пикротоксина) приводила к возникновению значительных по амплитуде токов как в интернейронах, так и пирамидных клетках (Рис. 3.1.3а). Неожиданным оказалось то, что величина тока была даже выше в пирамидных клетках, чем в интернейронах (55 ± 13 пА; n=4 в интернейронах; 153 ± 26 пА; n=5 в пирамидных клетках; p=0,02 t-тест между двумя типами клеток; Рис. 3.1.3б). Эти результаты указывают на наличие ГАМК_C-подобных рецепторов в обоих типах клеток и даже на более высокое их содержание в пирамидных нейронах. Однако, мы не стали сразу делать заключение о том, что полученный ток вызван ГАМК_С рецепторами. Существует предположение, что CACA может содержать небольшие количества (до 0,1 %) своего трансэнантиомера ТАСА (транс-аминокротоновой кислоты) – рацемическая смесь (Johnston 1996). TACA – более мощный агонист ГАМК_А рецепторов, чем CACA (Kusama et al. 1993). Возможно, что ток, который возникает при аппликации CACA, на самом деле, происходит от активации ГАМК_А рецепторов, опосредованной примесью ТАСА. Чтобы проверить это, мы апплицировали различные концентрации TACA. Низкая концентрация ТАСА (50 нМ), соответствующая ее содержанию 0,1 % в CACA (50 µМ) не вызвала никакого тока. Нам удалось получить сравнительно небольшой ток (24 ± 15 % от тока вызываемого аппликацией 50 mМ CACA; n=5; p=0,03; Рис. 3.1.4а) только при концентрации TACA 2,5 mМ, что соответствует 5 % от использованной концентрации CACA. Даже при аппликации TACA в концентрации 15 mМ (33,3 % от САСА) нам не удалось получить тока, достигающего по величине ток, полученный при аппликации CACA (72 ± 11 % от CACA тока; n=5; p=0,03).

Таким образом, CACA вызывает значительный по величине ток в концентрации <1 % от K_d для ГАМК_А рецепторов (9.7 мМ) (Kusama et al. 1993) и этот эффект не связан с содержанием в этом веществе TACA, более мощного агониста ГАМК_А рецепторов.

Другое возможное объяснение возникновения тока при аппликации CACA может быть связано с ее непрямым действием на ГАМК_А рецепторы. Было показано, что CACA вызывает высвобождение H³-ГАМК в срезах мозга при концентрации приблизительно в 10 выше, чем EC₅₀ для ГАМК_С рецепторов (Chebib and Johnston 1997). Этот эффект был связан с ее влиянием на GAT3 (транспортер ГАМК) и исчезал при аппликации 100 mМ b‑аланина, блокатора данного транспортера.

 

 

Рис. 3.1.4 Ток, вызываемый аппликацией CACA, связан с прямой активацией ионотропных ГАМКергических рецепторов

а, Аппликации TACA 2,5 µМ () и 15 µM () производили меньшие по амплитуде токи, чем CACA 50 µМ (). а₁, Эффект аппликаций ТАСА и САСА на ток компенсации. Данные, полученные с одного нейрона. Ток компенсации до аппликации агонистов был приравнен к нулю (пунктирная линия) a₂, Данные, усредненные по нескольким клеткам. Ток, полученный при аппликации 2,5 µМ (Т2.5; 5% от концентрации CACA) составлял 24 ± 15 % (n=5), при аппликации 15 µМ (Т15; 33% от концентрации CACA) – 72 ± 11 % (n=5) от тока вызываемого CACA 50 µМ (С50). Эти данные выступают против гипотезы, что ток вызываемый аппликацией CACA (селективного агониста ГАМК_С рецепторов) связан с содержанием в веществе небольших концентраций (<0,1 %) стереоэнантиомера TACA, более эффективного агониста ГАМК_А рецепторов. б, Аппликация CACA 50 µМ в присутствии β-аланина 100 µМ (блокатора GAT3 – транспортера ГАМК) вызывала ток (), который не значительно отличался от CACA-тока при базовых условиях (). б₁, Эффект аппликаций на ток компенсации. Данные, полученные с одного нейрона. Ток компенсации до добавления β-аланина был приравнен к нулю (верхняя пунктирная линия). β-аланин сам по себе увеличивал ток компенсации (нижняя пунктирная линия). б₂, Усредненный по нескольким клеткам (n=5) СACA-опосредованный ток, полученный в присутствии 100 µМ β-аланина (β-ала) составил 98 ± 11 % от тока вызываемого CACA при базовых условиях (кон.). Эти данные выступают против гипотезы, что ток вызываемый аппликацией CACA связан с гетерообменом CACA/ГАМК при участии ГАМК транспортера GAT3.

Чтобы исключить непрямое действие САСА через ГАМК транспортер, мы провели ее аппликацию в присутствии 100 mМ b‑аланина. b‑аланин сам по себе приводил к возникновению входящего тока (Рис. 3.1.4б). Возникновение этого тока может объясняться как блокадой обратного захвата (uptake) ГАМК, так и прямым агонистическим действием b‑аланина на глициновые рецепторы. В этих условиях аппликация CACA (50 mМ) также приводила к возникновению тока, незначительно отличающегося от тока без b‑аланина (98 ± 11 % - ток в присутствии b‑аланина от тока без него; n=5; p=0,8). Таким образом, аппликация CACA активировала ГАМКергические рецепторы прямо, а не через накопление ГАМК, влияя на транспортер GAT3. Этот результат указывает на наличие как в интернейронах, так и пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа тока, чувствительного к агонистам ГАМК_С рецепторов.

Таким образом, нами впервые была продемонстрирована фармакологическая активность агониста ГАМК_С рецепторов в гиппокампе. Однако, в этих экспериментах нам не удалось объяснить различную чувствительность интернейронов и пирамидных клеток к пикротоксину. Для ответа на этот вопрос, мы решили проверить, каким образом ГАМКергические токи в интернейронах и пирамидных клетках будут модулироваться аллостерическими модуляторами ГАМК_А рецепторов.