Твердофазний імуноферментний аналіз

Етапи методики	Реагенти
АГ (віруси в суспензії) зв'язуєтьсяз твердоюфазою	ТФ - полістирен, поліпропілен, гелі декстрана, ага рози, поліакриламіда. целюлозу, нітроцелюлозу, нейлон. Тверда фаза має вигляд гелей, кульок, дисків, титраційних панелей. Практично всі методики ІФА виконуються на полівінілових або полістиренових 96-луночних панелях. Вони вкриті спеціальними реагентами, які покращують прикріплення (адсорбцію) антигенів. Такими спеціальними реагентами єцианбромід, полі-лізин, глутаровий альдегід.Обробка проводиться при кімнатній температурі впродовж 1 години. Потім лунки промивають і вносять в них суспензію АГ (хромосоми, віруси, бактерії, клітини еукаріот). АГ інкубують 45 хв. потім фіксують) 0,1-0,25% глутаровим альдегідом 3-5 хв.
Блокування вільних місць на поверхні ТФ	На твердій фазі білкові молекули краще адсорбуються при низьких концентраціях в буферних розчинах та фізіологічних значеннях рН (7.2- 7.4). Тому в лунки панелей вносять такі концентрації АГ: 1-10 мкг /мл (білки). 500мкг/мл. (поліцукри). 5*10^3-5*10^4 клітин/мл. Після проведення 1 стадії аналізу здійснюють промивання. На поверхні панелей залишаються вільні місця, до яких можуть прикріплюватись будь-які молекули на наступних стадіях аналізу. Тому їх блокують 0.2-0.%% розчинами желатини. 1-5% сироваткою, 1% бич'їм у-глобуліном та ін. розчинами.
Реагенти, отримані шляхом адсорбції можна зберігати тижні або місяці при 4°С. Для попередження десорбції додатково вносять 0,02% азид натрію.
Взаємодія адсорбованого АГ з АТ1	До антигену додається специфічне антитіло. Інкубація здійснюється при 4°С впродовж 12-14 годин або при кімнатній температурі 2 години. Після інкубації незв'язані молекули відмивають.
До системиТФ-АГ-АТ1 додаютьАТ2, зв'язані з ферментом	АТ2 здатні зв'язуватись з певними ділянками (епітопами) АТ1. Тобто вони є антиантитілами,так як сприймають ділянки молекули імуноглобуліна як антигени. До АТ2 за допомогою досить складної методики приєднано фермент (каталаза, уреаза, амілаза, лізоцим, пероксидаза хріну, лужна фосфатазатощо) Етап кон’югації досить складний, тому виконується різними методами на спеціалізованих підприємствах. Знову проводиться інкубація (при кімнатній температурі 1.5 -2 години) та відмивка нереагуючих молекул.
До системиТФ-АГ-АТ1 -АТ2- Фдодають певний субстраттаречовину-індикатор	В таких умовах фермент розщеплює субстрат. Індикаторними речовинами можуть бути хромогени, пірогалол, 2- або 4-нітрофеноли тощо. Вибір субстрату визначається специфічністю ферменту, вибір індикатору - залежить від різних обставин, в тому числі і від типу твердої фази (пластикові панелі або нітроцелюлозні мембрани).
Облік результатів реакції проводять за допомогою спектрофотометру. Саме цей прилад фіксує зміну забарвлення на фінальній стадії аналізу.

 

Рис.11 Схема твердо фазного ІФА:ELISA-метод(сандвіч метод, або метод подвійних антитіл; В.М.Сюрін та ін., 1986):

Адсорбція антитіл; 2-внесення дослідного антигену; 3-внесення мічених ферментом антитіл; 4-додавання субстрату та утворення кольорового продукту ферментативної реакції.

Ферменти та їх субстрати, які найчастіше використовуються в ІФА