Використання культури клітин у вірусології

Впровадження культури клітин ознаменувало інтенсивний розвиток вірусологічних методів діагностики. З їх використанням були виділені і відкриті більшість невідомих раніше вірусів, вивчені точні механізми взаємодії вірусу з клітинами, розширились можливості одержання дігностичних і вакцинних препаратів (табл. 13).

Таблиця 13.

Основні клітинні культури, що застосовуються

Для виділення вірусів

 

Клітинні культури	Джерело	Віруси
Первинні клітинні культури
Культура клітин амніону людини		Ентеровіруси
Культура клітин фібробластів курячих ембріонів		Альфа віруси; віруси грипу А,В; параміксовіруси; віруси віспи; рабдовіруси; лейковіруси
Диплоїдні клітинні штами
WI-38	Клітини легень ембріону людини	Аденовіруси людини; вірус простого герпесу; цитомегаловіруси; ентеровіруси; вірус червоної висипки
Клітинні лінії, що перевиваються
HeLa	Клітини карциноми шийки матки людини	Рабдовіруси; параміксовіруси;, флавівіруси; ріновіруси; ентеровіруси; аденовіруси
HEP-2	Клітини епітеліоми (епітеліальної карциноми) гортані людини	Аденовіруси; вірус простого герпесу
КВ	Клітини карциноми носоглотки людини	Парвовіруси, (підрод аденоасоційованих вірусів; потрібне одночасне зараження аденовірусами); ріновіруси; парамиксовіруси
Vero	Клітини нирок південноафриканської мавпи	Параміксовіруси; альфавіруси; флавівіруси
ВНК-21	Клітини нирок молоді китайського хом'яка	Рабдовіруси; альфа віруси;, флавівіруси

 

Культура клітин – найбільш економічна вигідна жива система, що заміняє курячі ембріони та організми чутливих тварин. Простота культивування, швидкість відтворення результатів, наочність змін, що виникають внаслідок репродукції вірусів, вігідно відрізняють цю систему від інших. Проте існують деякі віруси, що важко адаптуються до культури клітин. Також не виключено існування феномену персистенції у них інших вірусів.

В наш час термін “культура клітин” став загальним поняттям, що включяє у себе також органні культури, в яких маленькі фрагменти тканин або цілі ембріональні органи експландуються з збереженням тканинної архітектури та культуру клітин, коли тканини діспергуються механічно, ферментативно, або шляхом спонтаннох міграції клітин з експлантату клітини розмножуються у вигляді суспензії або моношару, адсорбованих на субстраті клітин.

Підбираючи той чи інший тип органної чи клітинної культури слід принимати до уваги, що органна культура на протязі довгого часу підтримує гістологічне та біохімічне діференціювання і після початкової травми, завданої експлантацією, стає, як правило, не здатною до розмноження на протязі декількох діб і навіть тижнів. Кількісні дослідження органних культур ускладнюютьсянавіть невеликою різницею в геометрії та складі експлантантів.

Культури клітин, напроти, не мають, як правило, структурної організації, втрачають характерну гістотипову архітектуру та пов’язані з нею біохімічні ознаки. Клітини в культурі розмножуються, що забезпечує одержання великої маси клітин та їх розподіл на ідентичні паралелі. Отримана клітинна популяція може бути збережена шляхом заморожування.

Як правило, культури, одержані з ембріональних тканин, краще виживають та більш активно ростуть, в порівнянні з культурами з відповідних дорослих тканин. Дорослі тканини мають, як правило, знижену проліферативну ативність (здатність до поділу), та біль високий вміст клітин спеціалізованих, асоційованих з неклітинним матриксом. Ембріональні тканини мають багато практичних переваг перед дорослими і широко використовуються в вірусологічній практиці.

Слід мати на увазі, підбираючи клітинну культуру для роботи, що нормальні тканини, на відміну від тканин пухлинних, мають обмежений час життя. Клітинні культури, отримані з пухлинних тканин, здатні до поділу практично без обмежень часу. Нормальні клітини ростуть як недиференційовані стволові клітини, або клітини-попередники. І наступне диференціювання в такій культурі супроводжується часто повним припиненням клітинної проліферації.

Клітинні культури, щойно виділені з тканини, носять назву первинних культур. Ця назва за ними зберігається до початку субкультивування (пересіву на свіже живильне середовище). Клітини первинної культури звичайно гетерогенні і характеризуються невисокою здатністю до поділу, але в них найбільш повно представлений типи клітин тієї тканини, звідки вони були одержані. Субкультивування забезпечує можливість продовжити життя культурі, отримати лінії клітин, проводити клонування. При цьому в багатьох випадках субкультивування призводить до втрати у спеціалізованих клітин ознак диференціації.

Після декількох пересівів лінія клітин або гине, або “трансформується” і стає постійною клітинною лінією. Різниця властивостей первинних та трансформованих клітин та великий період часу (іноді декілька місяців), перед появою “переживаючих” клітин дає змогу припустити мутаційну природу їх появи. Неможливо виключити також і наявність в популяції первинних клітин так званих “безсмертних” клітин, особливо в культурах, одержаних з пухлин.

Поява постійної лінії клітин констатується за морфологічними змінами (зменшення розміру клітин, зниження їх здатності до закріплення на субстраті – адгезивності,округлення та збільшення ядерно-цитоплазматичного відношення), по скороченню часу, потрібного на поділ (з 36 – 48 до 12 – 36 годин), по зниженню залежності від сироватки, по збільшенню гетероплоїдності.

Таким чином, до переваг постійних ліній клітин відноситься їх більша швидкість росту. Можливість виходу більшої біомаси, можливість розмножуватись у простіших середовищах, здатність до росту в суспензії. До недоліків цих ліній відноситься хромосомна нестабільність, відхилення від фенотипу донора та втрачання специфічних тканевих маркерів.

 

3.6. Індикація вірусів у живих системах

 

В організмі чутливих тварин виникають клінічні симптоми захворювання, відставання в розвитку та загибель новонароджених. В уражених вірусом органах з’являються характерні гістологічні зміни, наприклад, віруси. У процесі репродукції вірусів у живих системах виникають зміни, що дають змогу виявити вірус, визначити якісно і кількісно його інфекційну активність.Для окремих представників кожної родинив вірусів характерні свої специфічнізміниКоксакі А та Коксакі В.

У курячого ембріона під час розмноження вірусів візуально визначають посилення оболонок ембріона, судинного малюнку, гіперемію, крововиливи, а також появу специфічних утворень у вигляді віспин, бляшок тощо. Наслідком репродукції вірусу є затримка розвитку або загибель курячго ембріона

Індикацію вірусу в культурі клітин здійснюють за цілою низкою специфічних і неспецифічних змін, що виникають у процесі їх репродукці

Включення поділяють, залежно від розташування, на ядерні (віруси герпесу, аденовіруси, поліомавіруси, флавівіруси та ін.), змін у культурах клітин належать:

1. Цитоплазматична дія (ЦПД) – її визначають як комплекс морфологічних змін у процесі взаємодії віруса з клітиною.

2. Включення, які розглядають як: а) очаги репродукції вірусу у клітині; б) накопичення вірусних часток або молекул їхніх білків; в) реакцію клітин на присутність у них вірусу.

3. Бляшкоутворення – здатність вірусів у присутності поживного покриття різного складу до локального розмноження у клітинній культурі з наступним руйнуванням сусідніх клітин і формуванням у клітинному моношарі дефектів – вірусних бляш цитоплазматичні (віруси віспи, грипу, сказу тощо) та змішані. Залежно від чутливості до барвника виділяють базофільні й ацидофільні включення. Їх також групують за розмірами, формою, ступінню прозорості.чисельністю.

Кожна бляшка формується як результат розмноження однієї вирусної частки, та відповідає одній бляшкотворній одиниці (БТО) інфекційної активності вірусу.

У культурах клітин відбуваються такі неспецифічні зміни: проникність плазматичної мембрани, сегментування, локалізація хроматину в ядрі, хромосомні аберації (структурні зміни хромосом), зморщування або пікноз ядра, вакуолізація цитоплазми тощо.

У деяких випадках неспецифічні зміни можуть переходити у специфічні, наприклад, вакуолізуючий вірус SV-40 спричиняє утворення вакуолей у цитоплазмі клітин. Реєстрування таких змін дає підставу твердити про наявність або відсутність вірусу в культурі кліин. Належність вірусу до певного типу можна встановити лише за допомогою серологічних реакцій.

 

6. Інтерференція – передбачає пригнічення цитопатичної дії. Реакція гемадсорбції – це здатність клітин, інфікованих вірусом, адсорбувати на своїй поверхні еритроцити. Ця реакція характерна для представників родин вірусів, що мають гемагглютинін у складі суперкапсидної оболонки (родини Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae).) проба, яка відбиває зміни метаболізму клітин у процесі репродукції у них вірусу, що впливає на показники рН культурального середовища.

 

7. Суперінфікування – поява цитопатичних змін у культурі клітин під впливом іншого вірусу.

 

8. Іммунофлюоресценція – специфічне світіння в культурах клітин, інфікованих вірусами, що виникає

під дією ультрафіолетового опромінення, у разі обробки сироватками, міченими флюорохромами дії одного вірусу під впливом іншого, або дією інтерферонів.

 

Титрування вірусів

 

Титрування виділених вірусів проводять з метою кількісного визначення вмісту вірусних часток в одиниці об’єму досліджуваного матеріалу. Титрування є обов’язковим етапом як виділення вірусів з клінічного матеріалу, так і їх подальшого типування та визначення біологічних властивостей збудника.

Методи титрування вірусів з використанням живих систем є різні:

1. Титрування вірусів у культурах клітин за методами:

а) кінцевого розведення з метою виявлення цитопатичної дії (ЦПД);

б) бляшкоутворення;

в) кольорової проби.

2. Титрування вірусів, що мають гемаглютинуючу активність, виділених на курячих ембріонах (титр означають у гемагглютинуючих одиницях – ГАО).

3. Титрування вірусів, виділених з використанням лабораторних тварин передбачає визначення дози, за якої збудник спричиняє загибель 50% інфікованих тварин, або характерні симптоми захворювання (титр ЛД₅₀ - летальна доза або ІД₅₀ - інфікуюча доза).