Экспериментальные методы исследования

 

Первые экспериментальные эндокриннологические исследования были выполнены Аддисоном, Бертольдом и Броун-Секаром в середине ХIХ в. В 1849 г. Аддисон подробно описал симптомы заболевания, связанного с разрушением ткани надпочечников (НП). Броун-Секар в 1856 г. первые опыты по удалению НП, подтвердил их витальное значение. 1849 г. – Бертольд показал, что трансплантация семенников кастрированным петухам предотвращает инволюционные изменения в их внесением облика и поведения после кастрации. Было сделано совершенно правильное заключение, что эффект трансплантации объясняется воздействием какого-то вещества, которые выделяют в кровь пересаженные половые железы.

Эти работы заложили основы 2-х важнейших направлений в экспериментальной эндокринологии.

I – изучение эффекта удаления эндокринных желез;

II – анализ репаративного эффекта трансплантации.

В 1899 г. Оливер и Шефер изучили в эксперименте влияние экстрактов мозгового вещества надпочечников на кровяное давление. Вскоре было выделено и изучено активное начало – адреналин, который вслед за тем удалось даже синтезировать искусственно.

Трансплантация эндокринных желез не сопровождается интенсивной иммунологической реакцией. Однако для терапии этот метод не применим. Наиболее употребительным и полезным методом служит пересадка органа из его нормального положения в организме в другое место. В этом случае единственным связующим звеном между трансплантатом и организмом служат сосуды, врастающие в трансплантат.

Эксперименты с перекрестным кровообращением

 

Блестящий эксперимент проведенный Леви в 1924 г., позволил впервые доказать, что нервный импульс сопровождается выделением химического вещества, послужил прообразом эксперимента с перекрестным кровообращением.

Сердце лягушки перфузировалось физиологическим раствором. При раздражении n.vagi – брадикардия. Если перфузионную жидкость, омывавшую это сердце, пропустить через другое сердце, то оно тоже начнет биться реже.

Вывод: при раздражении n.vagi высвобождается какое-то химическое вещество, которое Леви назвал «вагусным веществом». В последующем он установил его природу – это ацетилхолин. За открытие химического механизма передачи возбуждения Леви удостоен Нобелевской премии 1936 г.

 

Перекрестное кровообращение на изолированном органе

 

Модифицированный вариант методики перекрестного кровообращения ввел в 1962 г. Копп при исследовании роли паращитовидной железы в регуляции концентрации ионов Са⁺⁺ в крови. Изолированную паращитовидную железу помещали во влажную камеру. Кровь собаки поступала к железе по артериям, а венозная кровь оттекающая от железы, направлялась в яремную вену другой собаки. Уровень кальция в крови, поступающей в изолированную паращитовидную железу, повышали до 2 мг%, добавляя хлористый кальций. Отмечалось быстрое снижение уровня кальция в плазме другой собаки. Сделан вывод о существовании быстродействующего гипокальциемического фактора, который вырабатывается паращитовидной железой и вызывает падение уровня кальция в крови. Метод перекрестного кровообращения с успехом применен для исследования гуморальных механизмов регуляции пищеварения.

 

Парабиоз

Парабиоз – установление постоянной связи между системами кровообращение двух животных. Для этого эксперимента отбирают молодых инбредных животных. Хирургическим путем накладывают кожно-мышечный анастомоз, соединяя, таким образом, двух животных. В процессе заживления ткани срастаются и устанавливается перекрестное кровообращение. Парабиотическое соединение оказалось полезным в исследованиях взаимосвязи между гипофизом и половыми железами.

В эндокринологических исследованиях широкое распространение получили разнообразные химические методы исследования.

Разделение и выделение гормонов. Первоначальная экстракция активного гормона из секретирующей его ткани часто бывает связана с огромными трудностями. Содержание гормона в ткани может быть очень небольшим, поэтому приходится обрабатывать большое количество сырья. Часто для того, чтобы получить несколько миллиграммов вещества, пригодного для анализа, приходится перерабатывать буквально тонны сырья. В 1977 году Нобелевской премией удостоены Роже Гиймен и Эндрю Шали за выделение в чистом виде либеринов и статинов из гипоталамуса.

При выделении гормонов из тканевого экстракта первым делом отделяют активный материал от многочисленных посторонних биологически активных веществ – тут и гистамин, и нуклеиновые кислоты, и ацетилхолин, и 5-окситриптамин, и адреналин, и норадреналин и др. От многих из этих веществ можно избавиться, используя для экстракции подходящие растворители. Затем экстракт подвергают разнообразной обработке с целью разделить его компоненты, которые затем проверяют на биологическую активность. К числу таких методов обработки относятся хроматография, электрофорез, ультрацентрифугирование и противоточное распределение.

Определение химической природы гормона. Получив относительно чистый препарат активного материала, определяют биофизическими и биохимическими методами его молекулярный вес, а также форму и строение его молекул. Для этой цели используют, в частности, методы, основанные на различной способности веществ к диффузии, на различиях в скорости седиментации и в поглощении видимого света или рентгеновских лучей (колориметрия, спектрофотометрия). Однако с помощью колориметрических и спектрофотометрических методов нельзя получить непосредственные данные о форме и размерах молекул. Для этой цели можно использовать методы, основанные на рассеянии рентгеновских лучей. Когда рентгеновские лучи падают на какое-нибудь вещество, большинство их проходит через образец, не отклоняясь от прямолинейного направления, если только при этом территория образца не слишком велика. Однако часть лучей при этом рассеивается, причем картина рассеяния зависит от сочетания атомов, из которых строятся молекулы этого вещества. В некоторых случаях по картине рассеяния рентгеновских лучей удается рассчитать структуру рассеивающего материала.

За установление химической структуры половых гормонов и путей их обмена Нобелевскую премию 1939 года получил Адольф Бутенандт. Он впервые выделил в чистом виде 3 половых гормона – эстрадиол, андростерон и тестостерон.

А. Бутенандт смог получить заслуженную им награду только через 10 лет после присуждения. Дело в том, что руководство нацисткой Германии еще в 1936 году запретило поданным рейха любые контакты с Нобелевским комитетом. Причиной такого вызывающего решения послужило присуждение в 1936 годуНобелевской премии мира выдающемуся немецкому журналисту Карлу фон Осецкому, который за симпатии к СССР и обличение фашизма в 1933 году был заключен в концлагерь Зонненбург. Под давлением мирового общественного мнения нацисты были вынуждены перевести тяжелобольного Осецкого в больницу, где представители Швеции вручили ему премию. Что касается Бутенандта, то ему, более того, руководством фашистской Германии было приказано вообще отказаться от премии, итолько в 1949 году он посетил Стокгольм, где из рукшведского короля получил премию и прочел свою знаменитую Нобелевскую лекцию.

Химический синтез гормонов. Очень важной частью исследования гормонов являются работы по их синтезу. Синтезировать гормоны – это значит уметь получать их в больших количествах, что очень важно не только для лечения заболеваний, связанных с различными типами эндокринной недостаточности, но также для изучения физиологического и фармакологического действия гормонов.

К числу гормонов, которые сейчас научились полностью синтезировать химическим путем, относятся полипептидные гормоны – окситоцин и вазопрессин, гастрин, адренокортикостероиды кортизол и кортизон, адреналин и норадреналин, и различные половые гормоны. Сложность строения многих гормонов, в частности белковых, создает слишком большие трудности для их синтеза, и потому такие важные гормоны, как гонадотропные гормоны гипофиза и инсулин, по-прежнему получают из тканей животных. Аминокислотный состав и аминокислотная последовательность у этих гормонов видоспецифичны – обстоятельство, которое необходимо всегда учитывать при введении этих гормонов людям или животным. Вот почему, скажем, фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), применяемый для лечения некоторых видов бесплодия у людей получают путем экстракции из человеческих гипофизов, взятых у трупов, – процедура очень сложная и трудоемкая.

В 1955 году Нобелевскую премию получил Винсент Дю Виньо, осуществивший первый искусственный синтез окситоцина и вазопрессина.

В настоящее время и в эндокринологию внедряются новые методы. В частности, с успехом используется генная инженерия. С помощью генно-инженерных методов синтезирован человеческий инсулин, гормон роста человека и т.д.

Клинические наблюдения имеют важное значение. Достаточно вспомнить об изучении клинической картины гипер- и гипофункции различных желез.

Первым лауреатом Нобелевской премии среди эндокринологов оказался хирург Теодор Кохер. В 1909 году он Нобелевский комитет присудил ему высокую награду, отметив заслуги хирурга в разработке им нового метода удаления щитовидной железы, при котором часть ее обязательно остается для того, чтобы не возникло недостаточности функции органа, ведущей к неминуемой гибели пациентов. Кохер собственноручно спас подобной операцией несколько тысяч человек, а общее число больных, которым помог его метод, как справедливо пишет болгарский историк науки В. Чолаков, «не поддается учету».

Филип Хенч обратил внимание на то, что у больных ревматическими заболеваниями при беременности или желтухе наступает выраженное облегчение состояния. Он правильно предположил, что улучшение самочувствия может быть обусловлено появлением в организме больных какого-то стероидного вещества, подобного либо половым гормонам, выделяемым при беременности в повышенных количествах, или желчным кислотам, накапливающиеся при желтухе. 21 сентября 1948 года была сделана первая попытка лечения кортизоном больного, страдавшего тяжелым хроническим суставным ревматизмом. Больной, который в течение 6 лет не мог подняться с постели из-за мучительных болей, самостоятельно встал. Таким образом, в 1948 году получила права гражданства кортикостероидная терапия, которая открыла новую эру в лечении ревматизма и спасла миллионы человеческих жизней. Научный мир по достоинству оценил это открытие. Кевдэлл, Хенч и Рейхштейн в 1950 году были удостоены Нобелевской премии.

Таким образом, для эндокринологических исследований применяются разнообразные методы. Это еще раз демонстрирует междисциплинарный характер эндокринологии. Их успех зависит от методов. Успехи очевидны, о чем свидетельствует и число Нобелевских лауреатов в этой области (из 81 премий, присужденных в области медицины и физиологии (на 1990 г.) – 15 – за успехи в области эндокринологии (17%)).