Тема заняття №17 Дослідження процесів біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів. Мікросомальне окислення, цитохром Р-450.

Цілі заняття:

Ø Трактувати біохімічні механізми функціонування детоксикаційної системи печінки: реакції мікросомального окислення та кон'югації в біотрансформації ксенобіотиків та ендогенних токсинів;

Ø Пояснювати молекулярні основи генетичного поліморфізму та індуцибельної природи цитохрому Р-450;

Ø Аналізувати причини розвитку толерантності до лікарських засобів при їх тривалому використанні;

Ø Пояснювати біохімічні основи розвитку недостатності функцій печінки за умов хімічного, біологічного та радіаційного ураження.

 

Теоретичні питання

1. Детоксикаційна функція печінки: біотрансформація ксенобіотиків та ендогенних токсинів.

2. Основні стадії біотрансформації чужорідних хімічних сполук в печінці:

• перша стадія - окислювально-відновлювальні та гідролітичні реакції;

• друга стадія - реакції синтезу, або кон'югації.

3. Реакції мікросомального окислення:

• мікросомальні оксигенази (монооксигенази);

• електронотранспортні ланцюги мембран ендоплазматичного ретикулуму;

• цитохром Р-450;

• каталітичний цикл функціонування цитохрому Р-450.

4. Генетичний поліморфізм та індуцибельність біосинтезу цитохрому Р-450.

5. Виникнення та природа розвитку толерантності до лікарських засобів.

6. Реакції кон'югації в гепатоцитах:

• реакції глюкуронування за участю УДФ-глюкуронової кислоти;

• реакції сульфатування за участю 3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфату;

• реакції метилування за участю S-аденозилметіоніну;

• реакції ацетилування за участю ацетил-S-KoA;

• реакції кон'югації з гліцином.

7. Приклади реакцій детоксикації ендогенних токсинів в печінці:

• знешкодження білірубіну - продукту розпаду гему;

• знешкодження скатолу та індолу — продуктів перетворення триптофану.

 

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення індикану в сечі (проба Обермейера).

Принцип методу. Індикан (тваринний індикан) — калієва сіль індоксилсульфату. Метод ґрунтується на перетворенні індикану в індоксил в процесі кислотного гідролізу ефірного зв'язку сильною мінеральною кислотою (хлористоводнева кислота). Утворений індоксил, в присутності тимолу, окислюється хлоридом заліза до індиголігнону — сполуки рожево-фіолетового кольору.

Хід роботи. До 4 мл сечі додають 2 мл 10% розчину ацетату свинцю [РЬ (СН3СООН)₂] для осадження жовчних пігментів, солей та інших речовин, що заважають проведенню реакції. Утворений осад відфільтровують. До 2 мл фільтрату додають 1 мл 5% розчину тимолу в 96% етиловому спирті та 2 мл реактиву Обермейера (0,4 г хлориду заліза - FeCl3, розчиненого в 100 мл хлористоводневої кислоти). Через 10 хв додають 1 мл хлороформу, обережно перемішують і спостерігають за утворенням двох шарів: верхнього - водного та нижнього - хлороформового. Нижній, хлороформовий шар забарвлюється в рожево-фіолетове забарвлення. При вираженій індиканурії інтенсивність забарвлення посилюється до червоно-фіолетового кольору. Це дає змогу робити напівкількісну оцінку результатів.

З метою подальшого уточнення отриманого результату, нижній хлороформовий шар відбирають піпеткою, переносять в іншу пробірку і додають декілька крапель 20% розчину тіосульфату натрію. За відсутності індикану в сечі забарвлення зникає після додавання тіосульфату натрію. При позитивній реакції, за наявності індикану в сечі, забарвлення шару хлороформу не зникає після додавання тіосульфату натрію.

Клініко-діагностичне значення. Індикан - калієва або натрієва сіль індоксил-сульфату міститься в нормальній сечі в слідових кількостях і не виявляється звичайними лабораторними методами. Гіперіндиканемію та появу великої кількості індикану в сечі (гіперіндиканурію) спостерігають у разі посилення процесів мікробного гниття білків в кишечнику при закрепах, завороті кишки, інших видів кишкової непрохідності або зниженні травної функції шлунково-кишкового тракту.

Посилений розпад білків в тканинах організму при злоякісних новоутвореннях, абсцесах, формуванні гнійних ексудатів, гнійних процесах у легенях, туберкульозі також супроводжується значним утворенням індикану та зростанням його вмісту в сечі.

 

Завдання 2. Визначення анін-n-гідроксилазної активності мікросом печінки.