Робота 4. Виявлення вітаміну К. Реакція з лужним розчином цистеїну.

Принцип методу. При наявності цистеїну вікасол (вітамін К) в лужному середовищі забарвлюється в лимонно-жовтий колір.

Хід роботи. У пробірку вносять по 5 крапель розчинів вікасолу та цистеїну і 5 мл 10% розчину їдкого натру (NaOH). Спостерігають за появою лимонно-жовтого забарвлення.

Клініко-діагностичне й практичне значення. Цей вітамін є антигеморагічним фактором і має пряме відношення до згортання крові. Роль у вітаміну К у згортанні крові зумовлена його участю в утворенні протромбіну, який є неактивним попередником ферменту тромбіну, що перетворює білок плазми крові фібриноген у фібрин. Фібрин є нерозчинним волокнистим білком, що приймає участь в утворенні кров'яного згустка. Для того, щоб протромбін міг активуватися і перетворитися на тромбін, він спершу повинен зв'язати іони Са2+. Нормальна молекула протромбіну містить декілька залишків особливої амінокислоти - γ-карбоксиглутамінової кислоти, яка й зв'язує іони Са2+. При нестачі вітаміну К місце залишків γ-карбоксиглутамінової кислоти займають залишки звичайної глутамінової кислоти. Відтак, порушується каскад згортання крові і, як наслідок, підвищується кровотеча.

Тема заняття № 14. Дослідження фізіологічних та біохімічних функцій крові: буферні системи, кислотно-основний стан. Патологічні форми гемоглобінів.

 

Цілі заняття

ØПояснювати значення фізіологічних і біохімічних функцій крові.

ØПояснювати механізм участі гемоглобіну в транспорті кисню і діоксиду вуглецю в легеневих капілярах і капілярах периферичних тканин.

ØКласифікувати молекулярні форми гемоглобінів в еритроцитах здорової людини і пояснювати виникнення патологічних форм гемоглобінів, їх оцінка в діагностиці патологічних станів.

ØВикористовувати результати біохімічного аналізу крові (норма і патологія) для оцінки стану здоров'я людини, механізму регуляції та підтримки кислотно-основного стану.

ØТрактувати норму та молекулярно-біохімічні механізми виникнення патологічних форм гемоглобінів та зміну основних біохімічних показників біохімії крові для діагностики функціонального стану організму людини.

 

Теоретичні питання

1.Кров - внутрішнє середовище організму. Роль крові в підтриманні гомеостазу.

· Склад крові, плазми, сироватки крові. Фізико-хімічні і біологічні властивості крові.

· Об'єм крові, рН крові. Форменні елементи крові: еритроцити, лейкоцити, тромбоцити. Норма і патологія.

2.Гемоглобін, його структура, властивості, види.

3.Патологічні стани гемоглобіну: гемоглобінопатії і таласемії.

4.Дихальна функція еритроцитів в легеневих капілярах та тканинах.

· Ефект Бора.

· Залежність ступеня оксигенації від парціального тиску кисню. S-подібна кінетика дисоціації оксигемоглобіну.

5.Кислотно-основний стан. Регуляція рН рідин в організмі:

· Порушення кислотно-основного стану: ацидоз метаболічний (кетоацидоз, лактат ацидоз, гломерулярний ацидоз) та респіраторний; алкалоз (метаболічний та респіраторний). Причини їх виникнення.

·Р оль нирок, органів дихання, тканин в регуляції кислотно-основного стану:

6.Буферні системи крові, їх види:

· роль буферних систем крові в підтриманні постійності рН крові;

· функції гідрокарбонатної, фосфатної, гемоглобінової та білкової буферних систем в організмі людини.

7.Основні типи гіпоксії, механізм їх виникнення, прийоми лабораторної діагностики:

· гіпоксія викликана зниженням рО₂ в повітрі, що вдихається (екзогенна гіпоксія);

· гіпоксія викликана порушенням постачання тканин киснем внаслідок розвитку патологічного процесу (легеневий тип, серцево-судинний, тканинний і немічний).

8.Роль системи ренін-ангіотензин в регуляції осмотичного тиску.

9.Гормони - регулятори осмотичного тиску крові.

10.Залежність біохімічних показників крові від метаболічних процесів в організмі.

11."Загальний аналіз" крові і „біохімія" крові. Що входить в цей зміст?

 

Практичні роботи

 

Завдання 1. Визначення гемінової групи гемоглобіну бензидиновою пробою.

Принцип методу. Для визначення гемінової групи використовують бензидинову пробу, яка базується на каталітичних властивостях похідних гемоглобіну (оксигемоглобіну, карбоксигемоглобіну).Продукт окислення бензидину має синій колір, який поступово може переходити в червоний. Проба дуже чутлива.

Хід роботи. В пробірку вносять 5 крапель розбавленої крові, додають 5, крапель розчину бензидину і 2-3 краплі перекису водню. Спостерігають за зміною кольору.

Клініко -дігностичне значення. Концентрація гемоглобіну в крові у жінок становить 120-140 г/л, у чоловіків - 130-140г/л. Зменшення концентрації гемоглобіну є основним лабораторним симптомом анемії. 3ниження рівня гемоглобіну в крові залежить від форми анемії.

 

Завдання 2. Біуретовий метод на кількісне визначення білків у плазмі крові.

Принцип методу. Пептидні групи здатні утворювати з солями міді в лужному середовищі комплекс, який має фіолетовий колір. Біуретова реакція служить доказом наявності речовин, у яких існує не менше двох пептидних зв'язків.

Хід роботи. У першу пробірку вміщують 0,1 мл 0,9% розчину хлориду натрію (контроль), у другу — 0,1 мл стандартного розчину білка (50 г/д), у третю, четверту і п'яту - по 0,1 мл дослідного розчину білка (задачі). В усі пробірки вливають по 5 мл біуретового реактиву. Перемішують і через 30 хв визначають екстинкцію (оптичну густину) за допомогою ФЕК у кюветах на 10 мм при червоному світлофільтрі (750 нм) проти контрольного розчину. Розрахунок проводять за формулою:

 

,

 

де X – концентрація речовин у дослідній пробі, г/л; А - концентрація речовин у стандартному розчині; В - екстинкція дослідного розчину; С - екстинкція стандартного розчину білка.

Клініко-діагностичне значення. У здорової людини вміст білків в крові становить від 60 до 80 г/л. Менше 60 г/л - гіпопротеїнемія: ентерит, хронічний панкреатит, опіки, хронічні захворювання нирок, масивні кровотечі, голодування, затримка солей і води. Більше 80 г/л - гіперпротеїнемія: ревматоїдний артрит, дифузні захворювання сполучної тканини (колагенози, бронхоектаз, цироз печінки), діарея, цукровий діабет.

У здорової людини практично не виділяється білок із сечею.

 

З авдання 3. Колоїдна проба Вельтмана на визначення стану білків крові.

Принцип методу. Білки — це колоїдні розчини, які зв'язують воду, не дозволяючи ій виходити із кров'яного русла. При взаємодії їх з осаджуючими речовинами відбувається зміна їх властивостей.

Хід роботи. До 0,1 мл плазми крові додають 4,9 мл дистильованої води, змішують і сюди ж добавляють 0,1 мл 0,5% розчину хлориду кальцію. Нагрівають. Охолоджують, спостерігаючи за появою осаду. Результати оцінюють за загальною кількістю кальцію в цій реакції. Норма — 0,4-0,5 мл.

Клініко-діагностичне значення. Проба Вельтмана використовується в діагностиці при захворюванні печінки, ревматизмі, туберкульозі легень.

 

Завдання 4. Якісне визначення кальцію, магнію, фосфору в плазмі крові.

Хід роботи. Іони кальцію визначають, додавши до 1 мл плазми крові 3-4 краплі насиченого розчину оксалату амонію — випадає осад. Іони магнію — до одержаного фільтрату від досліду першого додають 3-4 краплі концентрованого розчину аміаку — утворюється осад. Фосфорну кислоту визначають молібдатом амонію і аскорбіновою кислотою. Інтенсивність голубого кольору прямо пропорційна концентрації фосфору в плазмі крові.

Норма кальцію 2,1-2,55 ммоль/л, магнію — 0,82-0,94 ммоль/л, фосфору — 0,87-1,45 ммоль/л (в сироватці).

 

Тема заняття № 11. Дослідження білків плазми крові: білки гострої фази запалення, індикаторні ферменти, ліпопротеїни.

 

Цілі заняття:

ØПояснювати основні функції білків плазми крові на основі їх фізико-хімічних властивостей.

ØПояснювати діагностичне значення зростання вмісту білків гострої фази запальних процесів.

ØПояснювати молекулярно-біохімічні механізми змін вмісту в плазмі кров: секреторних і тканинних ферментів, атерогенних і антиатерогенних ліпопротеїнів.

ØПояснювати біохімічні основи функціонування систем регуляції тиску крові (калікреїн-кінінова та ренін-ангіотензивна системи) та науково обгрунтоване застосування гіпотензивних лікарських засобів — інгібіторів ангіотензин перетворюючого ферменту.

 

Теоретичні питання

1. Основні групи білків плазми крові, їх склад та вміст в нормі і при патології.

2. Фактори, що впливають на вміст білків у плазмі крові: гіпер- та гіпопротеїнемії.

3. Білки гострої фази запалення: С-реактивний білок, церулоплазмін, гаптоглобін, кріоглобулін, α1-антитрипсин, α2-макроглобулін, інтерферон. Їх діагностичне значення.

4. Ферменти плазми крові: власні (секреторні) та індикаторні(тканинні) ферменти.

5. Діагностичне значення дослідженя активності ферментів та ізоферментів плазми крові: креатинфосфокінази, ЛДГ, АсТ, АлТ, амілази, ліпази

6. Калікреїн-кінінова система, її біологічна роль.

7. Ліпопротеїни плазми крові:

· класифікація: ХМ, ЛПДНЩ, ЛППЩ, ЛПНЦ, ЛПВЩ.

· схема будови ліпопротеїнів;

· метаболізм та функціональне значення окремих класів ліпопротеїнів плазми крові.

· гіпер- і гіпопротеїнемії, їх види, прояви. Гіперліпопротеїнемія та атеросклероз.

· молекулярно-біохімічні механізми атеросклерозу.

8. Гіперліпопротеїнемія та гіперхолестеринемія - загроза розвитку атеросклерозу

9. Роль глутатіону в захисті від пероксидного окисленні ліпідів, вітаміни-антиоксиданти.

10. Залишковий азот плазми крові.

 

Практичні роботи

Завдання 1. Фракціонування білків плазми крові методом висолювання: визначення альбумінів і глобулінів плазми крові.

Принцип методу. Білки, в залежності від величини заряду і молекулярної ваги, з водного розчину осаджуються мінеральними, органічними кислотами та розчинами солей різної концентрації.

Хід роботи. В пробірку вносять 2 мл плазми крові, добавляють 2 мл 50% розчину сульфату амонію. Випадає осад — це глобуліни. У фільтраті залишились альбуміни, які осаджуються 100% насиченим розчином сульфату амонію.

Клініко-діагностичне значення. Осадження білків застосовують для виділення білків із тканин, виявлення їх у різних біологічних рідинах, розділення суміші білків.

Завдання 2. Визначенн типів ліпопротеїнів по вмісту в них холестерину.

Принцип методу. Співвідношення і вміст ліпопротеїнів може мінятися при патологічних станах, що дозволяє використовувати результати кількісного визначення ліпопротеїнів в діагностиці. При взаємодії з концентрованою сірчаною кислотою утворюється різної сили червоний колір (ліпопротеїни мають різний вміст холестерину, який і дає відтінки кольору).

Хід роботи. В пробірки №1 і №2 наливають по 5 крапель плазми крові потім добавляють 5 крапель концентрованої сірчаної кислоти і спостерігають за зміною кольору.

Клініко-діагностичне значення. Норма в крові 3-7 ммоль/г загального холестерину. Збільшення його пов'язане з віком, розвитком різних хвороб: ІХС, інфаркту міокарда, хвороб печінки, цукрового діабету.

Гіпохолестеринемія — зниження рівня холестерину, характерне при захворюваннях ЦНС, гіпотиреозі, гострому панкреатиті, гострих інфекційних хворобах, ревматизмі, гемолітичній жовтяниці.