Тема заняття №2. Дослідження реплікації днк та транскрипції рнк.

Цілі заняття:

Ø Трактувати молекулярно-біологічні закономірності збереження та передачі генетичної інформації, роль ферментних систем, що забезпечують напівконсервативний механізм реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів;

Ø Пояснювати механізми функціонування ферментної системи транскрипції РНК.

 

Теоретичні питання

1. Біологічне значення реплікації ДНК.

2. Сутність відкриття Дж. Уотсона та Фр. Кріка (1953).

3. Напівконсервативний механізм реплікації; схема експерименту М.Мезелсона та Ф.Сталя.

4. Загальна схема біосинтезу ДНК.

5. Ферменти реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів.

6. Молекулярні механізми реплікації ДНК:

· топологічні проблеми (топоізомерази, хелікази);

· значення антипаралельності ланцюгів ДНК;

· фрагменти Оказакі.

7. Етапи синтезу дочірніх ланцюгів молекул ДНК.

8. Загальна схема транскрипції; кодуючі та некодуючі ланцюги ДНК.

9. РНК-полімерази прокаріотів та еукаріотів.

10. Етапи та ферменти синтезу РНК.

11. Сигнали транскрипції: промоторні, ініціаторні, термінаторні ділянки генома.

12. Процесінг - посттранскрипційна модифікація РНК.

13. Афідиколін - інгібітор реплікації - як протипухлинний препарат.

14. Антибіотики - інгібітори транскрипції, їх застосування.

 

Практичні роботи

Завдання 1. Пояснити механізм утворення подвійної спіралі ДНК.

Завдання 2. Пояснити механізм утворення шпильок в молекулі тРНК.

Завдання 3. Поясніть механізм дії афідиколіну.

Завдання 4. Поясніть механізм дії актиноміцину D.

Завдання 5. Обгрунтуйте механізм дії антибіотиків - інгібіторів ініціації транскрипції: рифаміцину, рифампіцину.

Завдання 6. Які надмолекулярні комплекси утворюють нуклеїнові кислоти? Визначити основні компоненти нуклеопротеїну (білка, азотистої основи, пентози, фосфорної кислоти) в його гідролізаті. Поясніть принципи методів.

 

Робота 1. Біуретова реакція на пептиди та білки.

Принцип методу. Всі білки та пептиди, крім дипептидів, з CuSО4в лужному середовищі (NaOH) утворюють комплексні сполуки, які зумовлюють фіолетове забарвлення розчину. Пептидні зв'язки реагують в енольній формі.

Матеріали та реактиви: гідролізат нуклеопротеїну, 10% розчин гідроксиду натрію, 1 % розчин сульфату міді, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вміщують 5 крапель гідролізату нуклеопротеїну, 10 крапель розчину NaOH, 2-3 краплі розчину CuSO4. Вміст пробірки перемішують. Розчин набуває фіолетового забарвлення.

 

Робота 2. Срібна проба на пуринові основи.

Принцип методу. Пуринові азотисті основи утворюють осад при реакції з нітратом срібла.

Матеріали та реактиви: гідролізат нуклеопротеїну, концентрований розчин амоніаку, 1% розчин нітрату срібла, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вмішують 10 крапель гідролізату нуклеопротеїну, нейтралізують розчином амоніаку, додають 5 крапель розчину нітрату срібла, вміст пробірки перемішують. Через 3-5 хвилин випадає пухкий осад срібних солей пуринових азотистих основ світло-коричневого кольору..

 

Робота 3. Реакція Троммера на рибозу та дезоксирибозу.

Принцип методу. Сполуки, що містять альдегідну групу, при нагріванні відновлюють Сu2+у складі Сu(ОН)2до Сu1+, а самі при цьому окислюються до відповідних карбонових кислот. Реакція супроводжується зміною кольору осаду: блакитний Сu(ОН)2перетворюється на жовтий CuOH і при подальшому нагріванні на цегляно-червоний Сu2О. Надлишок сульфату міді маскує реакцію, тому що Сu(ОН)2при нагріванні розпадається на оксид міді СuО2 чорного кольору і воду.

Матеріали та реактиви: гідролізат нуклеопротеїну, 30% розчин гідроксиду натрію, 7% розчин сульфату міді, газовий пальник, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вміщують 5 крапель гідролізату нуклеопротеїну, додають 10 крапель розчину гідроксиду натрію, 3-5 крапель розчину сульфату міді (до появи помутніння, яке не зникає), вміст пробірки перемішують, далі нагрівають до кипіння. Забарвлення змінюється. Випадає цегляно-червоний осад Cu2O.

 

Робота 4. Молібденова проба на фосфорну кислоту.

Принцип методу. Фосфорна кислота при нагріванні з молібденовим реактивом утворює фосфомолібдат амонію жовтого кольору.

Матеріали та реактиви: гідролізат нуклеопротеїну, молібденовий реактив (розчин 7,5 г молібдату амонію в 100 мл води і 100 мл 32% азотної кислоти, р = 1,2), газовий пальник, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вміщують 10 крапель молібденового реактиву, додають 5 крапель гідролізату нуклеопротеїну, нагрівають до кипіння.

Забарвлення стає лимонно-жовтим. При охолодженні випадає жовтий кристалічний осад комплексної сполуки - фосфомолібдату амонію.