Модуль 3. Молекулярна біологія. Біохімія міжклітинних комунікацій.

Модуль 3. Молекулярна біологія. Біохімія міжклітинних комунікацій.

Біохімія тканин та фізіологічних функцій

 

Змістовий модуль 12. Основи молекулярної біології.

 

Тема заняття №1. Дослідження біосинтезу та катаболізму пуринових та піримідинових нуклеотидів. Визначення кінцевих продуктів їх обміну.

Цілі заняття:

Ø Аналізувати послідовність реакцій біосинтезу та катаболізму пуринових нуклеотидів, порушення синтезу сечової кислоти і біохімічні основи розвитку подагри;

Ø Аналізувати послідовність реакцій біосинтезу та катаболізму піримідинових нуклеотидів.

 

Теоретичні питання

 

1. Біосинтез пуринових нуклеотидів.

2. Схема реакцій синтезу ІМФ.

3. Утворення АМФ, ГМФ, АТФ, ГТФ.

4. Регуляція біосинтезу пуринових нуклеотидів за принципом негативного зворотного зв'язку (ретроінгібування).

5. Біосинтез піримідинових нуклеотидів: реакції; регуляція.

6. Біосинтез дезоксирибонуклеотидів.

7. Утворення тимідилових нуклеотидів.

8. Інгібітори біосинтезу дТМФ як протипухлинні засоби (структурні аналоги дТМФ, похідні птерину).

9. Катаболізм пуринових нуклеотидів: реакції, кінцеві продукти.

10. Катаболізм піримідинових нуклеотидів: кінцеві продукти, їх подальша доля в організмі.

11. Спадкові порушення обміну сечової кислоти.

12. Клініко-біохімічна характеристика гіперурикемії, подагри, синдрому Леша-Ніхана.

 

Практичні роботи

Завдання 1. Визначити вміст сечової кислоти в біологічній рідині з Реактивом Фоліна. Поясніть принцип методу.

Принцип методу. Сечова кислота відновлює фосфовольфрамовий реагент з утворенням сполуки блакитного кольору з максимумом світлопоглинання при 640 нм. Оптична густина прямо пропорційна концентрації сечової кислоти в пробі.

Матеріали та реактиви: сироватка або плазма крові, 10% розчин дигідрогенвольфраматгідрату натрію, розчин карбонату натрію (10,3/100 мл), 0,35 М сірчана кислота, реактив Фоліна (фосфовольфрамовий реагент), стандартний розчин сечової кислоти для калібрування (30 мкМ), пробірки, піпетки, центрифуга.

Хід роботи. В центрифугувальну пробірку вміщують 0,5 мл сироватки крові та 4 мл дистильованої води. Вміст пробірки перемішують і додають по 0,25 мл розчинів сірчаної кислоти та вольфрамату натрію. Вміст пробірки перемішують і через 5 хвилин центрифугують протягом 10 хвилин із швидкістю 3000 об/хв. В надосадовій рідині визначають вміст сечової кислоти.

 

Визначення вмісту сечової кислоти в сироватці крові.

Реактиви	Контрольна проба, мл	Стандартна проба, мл	Дослідна проба, мл
Надосадова рідина	-	-
Стандартний розчин сечової кислоти	-		-
Вода дистильована		-	-
Розчин карбонату натрію
Фосфовольфрамовий реагент	0,5	0,5	0,5

 

 

Вміст пробірок перемішують. Через 30 хвилин визначають оптичну густину стандартної та дослідної проб при 640 нм (або 590-700 нм, червоний світлофільтр) проти контрольної проби у кюветі завтовшки 10 мм. (Забарвлення є стабільним протягом 30 хвилин).

Розрахунок вмісту сечової кислоти проводять за формулою: С = D0/Dc•30•10, де

С - вміст сечової кислоти в дослідній пробі, мкмоль/л;

Do- оптична густина дослідної проби;

Dс-оптична густина контрольної проби;

30 - вміст сечової кислоти у стандартному розчині;

10 - величина розведення сироватки.

Клініко-діагностичне значення.

У чоловіків вміст сечової кислоти в сироватці крові за цим методом становить 240-500 мкмоль/л, у жінок - 160-400 мкмоль/л.

Підвищення рівня сечової кислоти в сироватці крові - гіперурікемія - спостерігається при посиленому розпаді клітин, порушенні її виведення з сечею, при подагрі, а також може бути наслідком вживання їжі, багатоїї на пурини; гіпоурікемія - при гепатоцеребральній дистрофії, лімфогранульомі, при вживанні кортикотропіну, саліцилатів та деяких інших ліків.

 

Література

Основна:

1. Губський Ю,І. Біологічна хімія. -Київ-Терношль: Укрмедкнига, 2000.-508 с.

2. Хмелевский Ю.В, Губский Ю.И., Зайцева С.Д. и др. Биологическая химия: Практикум. - К: Вища шк., 1985. - 212 с.

Додаткова:

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф.Биологическая химия.-М.:Медицина, 1998.-704 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. Підручник.-Тернопіль: Укрмедкнига, 2002.-744 с

3. Ленинджер А. Основи биохимии: В 3 т. - М: Мир, 1985. -1056 с.

 

Практичні роботи

Завдання 1. Пояснити механізм утворення подвійної спіралі ДНК.

Завдання 2. Пояснити механізм утворення шпильок в молекулі тРНК.

Завдання 3. Поясніть механізм дії афідиколіну.

Завдання 4. Поясніть механізм дії актиноміцину D.

Завдання 5. Обгрунтуйте механізм дії антибіотиків - інгібіторів ініціації транскрипції: рифаміцину, рифампіцину.

Завдання 6. Які надмолекулярні комплекси утворюють нуклеїнові кислоти? Визначити основні компоненти нуклеопротеїну (білка, азотистої основи, пентози, фосфорної кислоти) в його гідролізаті. Поясніть принципи методів.

 

Робота 1. Біуретова реакція на пептиди та білки.

Принцип методу. Всі білки та пептиди, крім дипептидів, з CuSО4в лужному середовищі (NaOH) утворюють комплексні сполуки, які зумовлюють фіолетове забарвлення розчину. Пептидні зв'язки реагують в енольній формі.

Матеріали та реактиви: гідролізат нуклеопротеїну, 10% розчин гідроксиду натрію, 1 % розчин сульфату міді, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вміщують 5 крапель гідролізату нуклеопротеїну, 10 крапель розчину NaOH, 2-3 краплі розчину CuSO4. Вміст пробірки перемішують. Розчин набуває фіолетового забарвлення.

 

Робота 2. Срібна проба на пуринові основи.

Принцип методу. Пуринові азотисті основи утворюють осад при реакції з нітратом срібла.

Матеріали та реактиви: гідролізат нуклеопротеїну, концентрований розчин амоніаку, 1% розчин нітрату срібла, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вмішують 10 крапель гідролізату нуклеопротеїну, нейтралізують розчином амоніаку, додають 5 крапель розчину нітрату срібла, вміст пробірки перемішують. Через 3-5 хвилин випадає пухкий осад срібних солей пуринових азотистих основ світло-коричневого кольору..

 

Робота 3. Реакція Троммера на рибозу та дезоксирибозу.

Принцип методу. Сполуки, що містять альдегідну групу, при нагріванні відновлюють Сu2+у складі Сu(ОН)2до Сu1+, а самі при цьому окислюються до відповідних карбонових кислот. Реакція супроводжується зміною кольору осаду: блакитний Сu(ОН)2перетворюється на жовтий CuOH і при подальшому нагріванні на цегляно-червоний Сu2О. Надлишок сульфату міді маскує реакцію, тому що Сu(ОН)2при нагріванні розпадається на оксид міді СuО2 чорного кольору і воду.

Матеріали та реактиви: гідролізат нуклеопротеїну, 30% розчин гідроксиду натрію, 7% розчин сульфату міді, газовий пальник, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вміщують 5 крапель гідролізату нуклеопротеїну, додають 10 крапель розчину гідроксиду натрію, 3-5 крапель розчину сульфату міді (до появи помутніння, яке не зникає), вміст пробірки перемішують, далі нагрівають до кипіння. Забарвлення змінюється. Випадає цегляно-червоний осад Cu2O.

 

Робота 4. Молібденова проба на фосфорну кислоту.

Принцип методу. Фосфорна кислота при нагріванні з молібденовим реактивом утворює фосфомолібдат амонію жовтого кольору.

Матеріали та реактиви: гідролізат нуклеопротеїну, молібденовий реактив (розчин 7,5 г молібдату амонію в 100 мл води і 100 мл 32% азотної кислоти, р = 1,2), газовий пальник, пробірки, піпетки.

Хід роботи. В пробірку вміщують 10 крапель молібденового реактиву, додають 5 крапель гідролізату нуклеопротеїну, нагрівають до кипіння.

Забарвлення стає лимонно-жовтим. При охолодженні випадає жовтий кристалічний осад комплексної сполуки - фосфомолібдату амонію.

Практичні роботи

Завдання 1. Пояснити протипухлинну дію антибіотиків. Чи всі антибіотики можуть бути використаними як протипухлинні?

Завдання 2. Обґрунтуйте механізм дії антибіотиків - інгібіторів ініціації трансляції: стрептоміцину, ауринтрикарбоксилової кислоти.

Завдання 3. Обгрунтуйте механізм дії антибіотиків - інгібіторів елонгації трансляції: аміцетину, хлорамфеніколу, еритроміцину, циклогексиміду, пуроміцину, тетрациклінів.

Завдання 4. Обґрунтуйте механізм дії антибіотиків – інгібіторів термінації трансляції: анізоміцину, хлорамфеніколу, еритроміцину, лінкоцину, стрептоміцину.

Завдання 5. Поясніть механізм дії інтерферонів як противірусних сполук та протипухлинних факторів.

Завдання 6. Поясніть механізм дії дифтерійного токсину.

 

 

Завдання 7. Визначення вмісту РНК в лужному гідролізаті нуклеопротеїну.

Принцип методу. Високомолекулярні нуклеїнові кислоти характеризуються смугою світлопоглинання із максимумом при 260 нм. Для лужного гідролізату нуклеопротеїну 1 одиниця екстінкції при 260 нм відповідає 32 мкг РНК/мл за умови вимірюванні в кюветі завтовшки 10 мм.

Матеріали та реактиви: лужний гідролізат нуклеопротеїну, 0,5 М розчин НСlO4, пробірки, спектрофотометр.

Хід роботи. В спектрофотометричну кювету завтовшки 10 мм вмішують гідролізат нуклеопротеїну і виміряють оптичну густину при 260 нм. Як контроль використовують розчинник - 0,5 М НСlO4Вміст РНК розраховують за формулою

СРНК= Е260•32 (мкг/мл).

Практичні роботи

Завдання 1. Ультрафіолетове опромінення шкіри викликає утворення димерів тиміну. При пігментній склеродермі чутливість шкіри до ультрафіолету призводить до раку шкіри. Поясніть молекулярний механізм захворювання. Якого ферменту немає у таких хворих?

Завдання 2. Сполука є мутагеном. Це доведено у дослідах на бактеріальних клітинах, Salmonella, які потребують гістидину для свого росту. Сполука викликає мутацію, врезультаті виникають бактеріальні клітини, які можуть рости без гістидину. Які хімічні мутагени Вам відомі?

Завдання 3. Поясніть відрізнення між плазмідами і генами. Як плазміди використовуються в генній інженерії?

Завдання 4. Глікогенози і аглікогенози, хвороби обміну та накопичення ліпідів, неможливість засвоєння фруктози, лактози, порушення обміну амінокислот, анемії та багато інших захворювань є спадковими. Більшість з них є аутосомно-рецесивними, проявляються лише в гомозиготному стані. Поясніть, які є шляхи запобігання розвитку спадкових хвороб.

Завдання 5. Обгрунтуйте, чому безпомилкове копіювання ДНК міліони разів є дуже важливим.

 

Тема заняття № 4Дослідження молекулярно-клітинних механізмів дії гормонів білково-нентидної природи та катехоламінів на клітини-мішені.

 

Цілі заняття:

Ø Аналізувати поняття про гормони та фізіологічно активні сполуки.

Ø Проаналізувати класифікацію гормонів, механізми впливу гормонів на клітини-мішені.

Ø Виявити гормони в досліджуваних розчинах.

 

Теоретичні питання

1. Визначення гормонів, як регуляторів процесів обміну в організмі.

2. Гормоноіди - тканинні гормони (гістогормони) - гуморальні регулятори не ендокринного походження.

3. Єдиний нейрогуморальний механізм регуляції.

4. Ендокринна система - як ефекторна система.

5. Секреція ендокринних залоз - як відповідь на стимули (напр. секреція інсуліну - при підвищенні вмісту глюкози в крові та виділення хоріонічного гонадотропіну стінками матки на початку вагітності після імплантації бластоцисти, підвищення секреції тироксину при тривалому перебуванні на холоді).

6. Класифікація гормонів (за місцем синтезу, хімічною природою, механізмом дії).

7. Мішені гормональної дії.

8. Механізми дії гормонів на клітини-мішені:

· дія на мембранні специфічні рецепторні білки;

· дія на внутрішньоклітинні рецептори.

9. Типи рецепторів для білково-пептидних гормонів та нейромедіаторів:

· іонотропні рецептори;

· метаботропні рецептори.

10. Молекулярна організація метаботрошних рецепторів.

11. Білки-трансдуктори - G-білки. Молекулярна будова. Типи G-білків.

12. Аденілатциклаза:

· структура аденілатциклази;

· утворення аденілатциклазного комплексу:

· білок-рецептор;

· G-білок;

· каталітична субодиниця аденілатциклази.

13. Вторинні месенджери та їх роль в механізмах гормонального впливу на клітини-мішені:

· цАМФ (структура, біологічна дія);

· цГМФ (структура, біологічна дія);

· фосфоінозитиди;

· іони кальцію.

14. Протеїнкінази - мішені для цАМФ.

15. Реалізація впливу адреналіну на клітини-мішені. Схема каскадної реакції.

Практичні роботи

Завдання 1. Виявити гормони білкової природи (реакції осадження).

Принцип методу. Білки легко осаджуються під дією ряду агентів, в тому числу і органічних кислот. Осадження білків і, зокрема, білків-гормонів сульфосаліциловою кислотою є чутливою та високо специфічною реакцією на їх виявлення в розчині.

Хід роботи. В пробірку вносять 1 мл досліджуваного розчину інсуліну і додають 3 краплі 20 % розчину сульфосаліцилової кислоти) При наявності в розчині інсуліну спостерігають за утворенням осаду.

Пояснити механізм осадження білків з розчину під дією сульфосаліцилової кислоти.

 

Завдання 2. Виявити гормони пептидної природи (біуретова реакція).

Принцип методу. Білки і пептиди взаємодіють з CuS04в лужному середовищі, утворюючи комплексні сполуки. Реакція обумовлюється наявністю пептидних зв'язків. Утворена комплексна сполука міді (біуретовий комплекс) має фіолетове забарвлення.

Хід роботи. В пробірку вносять 5 крапель досліджуваного розчину, 5 крапель 5 %-го розчину NaOH, 1 краплю 1 %-го розчину CuSO4. Спостерігають за появою рожево-фіолетового забарвлення. В суміші не повинно бути надлишку сульфату міді, оскільки утворений за цих умов гідроксид міді, може змінювати колір розчину. З проведеного експерименту зробити висновки.

 

Практичні роботи

Завдання 1. Визначити йодвмісні гормони (тироксин, Т3та Т4) в біологічних рідинах.

Принцип методу. Гормони щитовидної залози (тироксин, трийодтиронін) містять в своєму складі йод. В процесі їх лужного гідролізу (кип'ятіння з КНСОз) утворюється йодид калію (КІО3). Йод легко витісняється з йодиду калію при дії на нього йодату калію (KІ) в кислому середовищі згідно рівнянню:

КІО3+ 5KІ + 3H2SО4→ 3І2+ 3K2SO4+ H2O

Йод, який виділяється, дає синє забарвлення з крохмалем:

І2+ крохмаль → синє забарвлення

Хід роботи. До 1 мл лужного гідролізату гормонів щитовидної залози додають сірчану кислоту до кислої реакції на лакмус, 4 краплі 1 % розчину крохмалю і 5 крапель 2 % розчину йодату калію. З'являється синє забарвлення. За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Практичні роботи

Завдання 1. Провести якісну реакцію на вміст в крові похідних амінокислот - адреналіну та норадреналіну (катехоламінів) - гормонів мозкової речовини наднирників (реакція з хлоридом заліза (III).

Принцип методу. Адреналін (метиламіноетанолпірокатехін) - гормон мозкової речовини наднирників - дає реакції, характерні для пірокатехінів. З іонами заліза (III) він утворює сполуку фенолятного типу - смарагдово-зеленого кольору. При подальшому додаванні лугу (NaOH), утворюється адренохром вишнево-червоного кольору.

Адреналін легко окислюється на повітрі, внаслідок чого розчин набуває червоного забарвлення. Характерною реакцією на виявлення адреналіну є також реакція з діазореактивом (суміш розчинів сульфанілової кислоти та нітрату натрію), що супроводжується появою червоного забарвлення.

Хід роботи. В пробірку вносять 10 крапель 0,1 %-го розчину адреналіну і додають 1 краплю 1 %-го розчину FeCl3. З'являється смарагдово-зелене забарвлення. До отриманого розчину вносять 1 краплю лугу (NaOH) - з'являється вишнево-червоне забарвлення.

За результатами проведеного експерименту зробити висновок.

 

Завдання 2. Виявити в сечі 17-кетостероїди - метаболіти гормонів кори наднирників і статевих залоз (реакція з м-динітробензолом).

Принцип методу. Поняття „17-кетостероїди" об'єднує стероїди, що містять карбонільну групу біля сімнадцятого атома вуглецю. Це метаболіти стероїдних гормонів кори наднирників та статевих залоз. 17-кетостероїди в досліджуваних розчинах виявляють за допомогою м-динітробензолу. Продукт конденсації 17-кетостероїдів з м-динітробензолом у лужному середовищі дає фіолетово-рожеве забарвлення. Інтенсивність забарвлення пропорційна кількості 17-кетостероїдів у сечі, що може бути використано для їх кількісного визначення.

Хід роботи. В пробірку вносять 1 мл сечі, 5 крапель 30 %-го розчину NaOH, 5 крапель 2 %-го розчину м-динітробензолу. Суміш в пробірці перемішують скляною паличкою. Через 2-3 хв. при наявності 17-кетдстороїдів з'являється фіолетово-рожеве забарвлення.

За результатами проведеного експерименту зробити висновок.

В нормі екскреція 17-кетостероїдів у чоловіків складає 44,5 ± 2,3 мкмоль за добу (12,8 ± 0,8 мг за добу), у жінок - 36,8 ± 2,4 мкмоль за добу (10,6 ± 0,7 мг за добу).

Клініко-діагностичне значення. Максимальну екскрецію 17-кетостероїдів у чоловіків та жінок спостерігають у 25-річному віці, після чого починається поступове їх зниження.

При стресах кількість 17-кетостероїдів у крові та сечі зростає.

В залежності від типу патології гіпо- чи гіперфункції надниркових залоз змінюється вміст кетостероїдів. Зокрема, при хворобі Аддісона (гіпофункція), гіпофізарному карликовому рості, гіпотиреозі, важких хворобах печінки (цироз) екскреція 17-кетостероїдів зменшується. На противагу цьому, при пухлинах наднирникових залоз (синдром Гценка-Кушинга) спостерігається підвищений вміст 17-кетостероїдів в сечі.

Паралельне визначення виісту вільних 17-кетостероїдів в плазмі крові та сечі дає можливість оцінити функціональний стан кіркової речовини надниркових залоз.

Про функціональний стан статевих залоз роблять висновок по вимірюванню добової екскреції тестостерону - найбільш активного андрогену, який утворюється в організмі людини. Добова екскреція тестостерону у чоловіків віком 25-35 років становить у середньому 70 мкг на добу, у жінок - 8 мкг на добу.

 

Практичні роботи

Завдання 1. Провести якісну реакцію на вміст кальцію в плазмі крові (реакція з оксалатом амонію).

Хід роботи. В три пробірки внести по 1 мл плазми крові проб. № 1, № 2, № 3. Проба № 1 містить плазму крові здорової людини. В кожну з пробірок внести по 1 мл насиченогр розчину щавлевокислого амонію (оксалат амонію). Спостерігати за помутнінням розчину та випаданням білого осаду щавелевокислбго кальцію. За ступенем помутніння розчину і кількістю утвореного осаду зробити висновки про вміст кальцію в пробах, а також про гормональний статус організму.

 

Завдання 2. Провести якісну реакцію на вміст фосфатів в плазмі крові (реакція з молібденовокислим амонієм).

Хід роботи. В три пробірки внести по 1 мл плазми крові проб. № 1, № 2, № 3. Проба № 1 містить плазму крові здорової людини. В кожну з пробірок внести по 2 мл молібденового реактиву (молібденовокислого амонію) і прокип'ятити декілька хвилин. Розчин жовтіє і при охолоджені утворюється жовтий осад фосфо-молібдато амонію. За кількістю утвореного осаду зробити висновки про вміст фосфатів в пробах.

Змістовий модуль 16. Біохімія харчування людини. Вітаміни як компоненти харчування.

 

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення глюкози в слині методом Фелінга (якісна реакція).

Принцип методу. Реакція грунтується на здатності альдегідної груни глюкози, при нагріванні в лужному середовищі окиснюватись, відновлюючи при цьому блакитний гідроксид міді (II) Cu(ОН)2в жовтий гідроксид міді (І) Cu(ОН). При подальшому нагріванні утворюється оксид міді (І) Cu 2О цеглянисто-червоного кольору.

Реактив Фелінга, який використовують в реакції, отримують при змішуванні рівних кількостей розчину сульфату міді (розчин Фелінга 1) та лужного розчину сегнетової солі (розчин Фелінга 2). В результаті взаємодії сульфату міді з лугом утворюється гідроксид міді (II), який тут же вступає в реакцію з сегнетовою сіллю з утворенням темно-синього розчину мідно-винного комплексу (реактиву Фелінга).

Весь гідроксид міді (II) в реактиві Фелінга комплексно зв’язаний з сегнетовою сіллю, що перешкоджає утворенню з нього чорного осаду оксиду міді (II) при нагріванні.

Хід роботи. В пробірку вносять 1 мл слини, додають 10 крапель розчину Фелінга і нагрівають до кипіння. За наявності глюкози в слині випадає жовтий осад Cu(ОН) або цеглянисто-червоний Cu2О. Інтенсивність забарвлення та кількість осаду залежать від вмісту глюкози в досліджуваній пробі слини.

 

Завдання 2. Виявити патологічні компоненти у шлунковому соку.

Хід роботи.

До 1 мл досліджуваного (патологічного) шлункового соку додають 5 крапель 10%-го розчину бензидину в оцтовій кислоті та 3 краплі 3%-го розчину пероксиду водню. За присутності крові розвивається синє або зелене забарвлені внаслідок окислення бензидину.

За результатами проведених експериментів зробити висновки.

Завдання 3. Дослідження активності ліпази підшлункової залози.

Принцип методу: Про активність панкреатичної ліпази судять кількості звільнених під дією ферментів жирних кислот, які відтитровують лугом.

Хід роботи: Три пробірки заповнюють за схемою, вміст пробірок інкубують на водяній бані при 37°С протягом 15 хв. Після інкубації проводять титрування ОД М розчином гідроксиду натрію в присутності фенолфталеїну Кількість лугу в мл, що пішла на титрування (нейтралізацію) звільнених жирних кислот, є показником активності ліпази.

Компоненти суміші	№ пробірки
Рослинна олія	0,5	0,5	0,5
Витяжка з підшлункової залози			-
Жовч	-
Буфер рН 7,8
Кількість NaOH, що пішла на титрування

Завдання 4. Кількісне визначення активності амілази слини методом Вольгемута.

Принцип методу. Метод Вольгемута грунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість фермента, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0,1%-го розчину крохмалю. Цюкількість фермента приймають за одиницю амілазної активності.

Амілазна активність виражається в кількості 0,1 %-го розчину крохмалю в мілілітрах, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл слини при температурі 37°С протягом 30хв. В нормі амілазна активність слини А = 160 - 320.

Хід роботи: У сім пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1 мл води. У 1-у пробірку додають 1 мл розведеної у 10 разів слини. Вміст добре перемішують і 1 мл отриманого розчину переносять з першої пробірки до другої, з неї - до третьої і т.д. Таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту буде у два рази меншим, ніж у попередній. Потім в усі пробірки наливають по 2 мл 0,1% розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки на водяну баню (чи у термостат) при 37°С на 30 хв. Після цього пробірки виймають та охолоджують для завершення дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду, добре перемішують та спостерігають за змінами кольору. Рідина у пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій колір. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначають синє, червоне та жовте забарвлення буквами "С", "Ч", "Ж". Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та розраховують активність амілази слини:

 

Показник	Пробірки
Розведення (слини чи сечі)	1/20	1/40	1/80	1/160	1/320	1/640	1/1280
Кількість 0.1% розчину крохмалю, мл
Забарвлення з йодом
Висновки:

 

 

Розрахунок. Для обчислення активності амілази необхідно знати розведення слини в останній пробірці, де відбувся повний гідроліз крохмалю.

Наприклад, остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою) в якій слина розведена у 160 разів. Складають пропорцію та обчисляють активність амілази:

X=

1/160 мл слини розщеплює 2мл 0,1 %-го розчину крохмалю;

1 мл слини розщеплює х мл 0,1 %-го розчину крохмалю,

звідки

Х =

Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовується в клінічній практиці для визначення амілазної активності крові та сечі. Зростання активності амілази (внаслідок збільшення кількості) в сироватці крові буде мати діагностичне значення для підтвердження наявності запалення підшлункової залози - панкреатиту. Внаслідок розвитку панкреатиту, при пошкодженні панкреацитів підвищується секреція панкреатичного соку, передчасне виділення та активація ферментів безпосередньо в протоках і клітинах залози. Внаслідок цього в кров попадають ферменти підшлункової залози, такі як трипсин і амілаза, активність якої в сироватці крові значно зростає.

 

Практичні роботи

Завдання 1. Виявлення та визначення вмісту водорозчинних вітамінів.

Цілі заняття

ØПояснювати значення фізіологічних і біохімічних функцій крові.

ØПояснювати механізм участі гемоглобіну в транспорті кисню і діоксиду вуглецю в легеневих капілярах і капілярах периферичних тканин.

ØКласифікувати молекулярні форми гемоглобінів в еритроцитах здорової людини і пояснювати виникнення патологічних форм гемоглобінів, їх оцінка в діагностиці патологічних станів.

ØВикористовувати результати біохімічного аналізу крові (норма і патологія) для оцінки стану здоров'я людини, механізму регуляції та підтримки кислотно-основного стану.

ØТрактувати норму та молекулярно-біохімічні механізми виникнення патологічних форм гемоглобінів та зміну основних біохімічних показників біохімії крові для діагностики функціонального стану організму людини.

 

Теоретичні питання

1.Кров - внутрішнє середовище організму. Роль крові в підтриманні гомеостазу.

· Склад крові, плазми, сироватки крові. Фізико-хімічні і біологічні властивості крові.

· Об'єм крові, рН крові. Форменні елементи крові: еритроцити, лейкоцити, тромбоцити. Норма і патологія.

2.Гемоглобін, його структура, властивості, види.

3.Патологічні стани гемоглобіну: гемоглобінопатії і таласемії.

4.Дихальна функція еритроцитів в легеневих капілярах та тканинах.

· Ефект Бора.

· Залежність ступеня оксигенації від парціального тиску кисню. S-подібна кінетика дисоціації оксигемоглобіну.

5.Кислотно-основний стан. Регуляція рН рідин в організмі:

· Порушення кислотно-основного стану: ацидоз метаболічний (кетоацидоз, лактат ацидоз, гломерулярний ацидоз) та респіраторний; алкалоз (метаболічний та респіраторний). Причини їх виникнення.

·Р оль нирок, органів дихання, тканин в регуляції кислотно-основного стану:

6.Буферні системи крові, їх види:

· роль буферних систем крові в підтриманні постійності рН крові;

· функції гідрокарбонатної, фосфатної, гемоглобінової та білкової буферних систем в організмі людини.

7.Основні типи гіпоксії, механізм їх виникнення, прийоми лабораторної діагностики:

· гіпоксія викликана зниженням рО₂ в повітрі, що вдихається (екзогенна гіпоксія);

· гіпоксія викликана порушенням постачання тканин киснем внаслідок розвитку патологічного процесу (легеневий тип, серцево-судинний, тканинний і немічний).

8.Роль системи ренін-ангіотензин в регуляції осмотичного тиску.

9.Гормони - регулятори осмотичного тиску крові.

10.Залежність біохімічних показників крові від метаболічних процесів в організмі.

11."Загальний аналіз" крові і „біохімія" крові. Що входить в цей зміст?

 

Практичні роботи

 

Завдання 1. Визначення гемінової групи гемоглобіну бензидиновою пробою.

Принцип методу. Для визначення гемінової групи використовують бензидинову пробу, яка базується на каталітичних властивостях похідних гемоглобіну (оксигемоглобіну, карбоксигемоглобіну).Продукт окислення бензидину має синій колір, який поступово може переходити в червоний. Проба дуже чутлива.

Хід роботи. В пробірку вносять 5 крапель розбавленої крові, додають 5, крапель розчину бензидину і 2-3 краплі перекису водню. Спостерігають за зміною кольору.

Клініко -дігностичне значення. Концентрація гемоглобіну в крові у жінок становить 120-140 г/л, у чоловіків - 130-140г/л. Зменшення концентрації гемоглобіну є основним лабораторним симптомом анемії. 3ниження рівня гемоглобіну в крові залежить від форми анемії.

 

Завдання 2. Біуретовий метод на кількісне визначення білків у плазмі крові.

Принцип методу. Пептидні групи здатні утворювати з солями міді в лужному середовищі комплекс, який має фіолетовий колір. Біуретова реакція служить доказом наявності речовин, у яких існує не менше двох пептидних зв'язків.

Хід роботи. У першу пробірку вміщують 0,1 мл 0,9% розчину хлориду натрію (контроль), у другу — 0,1 мл стандартного розчину білка (50 г/д), у третю, четверту і п'яту - по 0,1 мл дослідного розчину білка (задачі). В усі пробірки вливають по 5 мл біуретового реактиву. Перемішують і через 30 хв визначають екстинкцію (оптичну густину) за допомогою ФЕК у кюветах на 10 мм при червоному світлофільтрі (750 нм) проти контрольного розчину. Розрахунок проводять за формулою:

 

,

 

де X – концентрація речовин у дослідній пробі, г/л; А - концентрація речовин у стандартному розчині; В - екстинкція дослідного розчину; С - екстинкція стандартного розчину білка.

Клініко-діагностичне значення. У здорової людини вміст білків в крові становить від 60 до 80 г/л. Менше 60 г/л - гіпопротеїнемія: ентерит, хронічний панкреатит, опіки, хронічні захворювання нирок, масивні кровотечі, голодування, затримка солей і води. Більше 80 г/л - гіперпротеїнемія: ревматоїдний артрит, дифузні захворювання сполучної тканини (колагенози, бронхоектаз, цироз печінки), діарея, цукровий діабет.

У здорової людини практично не виділяється білок із сечею.

 

З авдання 3. Колоїдна проба Вельтмана на визначення стану білків крові.

Принцип методу. Білки — це колоїдні розчини, які зв'язують воду, не дозволяючи ій виходити із кров'яного русла. При взаємодії їх з осаджуючими речовинами відбувається зміна їх властивостей.

Хід роботи. До 0,1 мл плазми крові додають 4,9 мл дистильованої води, змішують і сюди ж добавляють 0,1 мл 0,5% розчину хлориду кальцію. Нагрівають. Охолоджують, спостерігаючи за появою осаду. Результати оцінюють за загальною кількістю кальцію в цій реакції. Норма — 0,4-0,5 мл.

Клініко-діагностичне значення. Проба Вельтмана використовується в діагностиці при захворюванні печінки, ревматизмі, туберкульозі легень.

 

Завдання 4. Якісне визначення кальцію, магнію, фосфору в плазмі крові.

Хід роботи. Іони кальцію визначають, додавши до 1 мл плазми крові 3-4 краплі насиченого розчину оксалату амонію — випадає осад. Іони магнію — до одержаного фільтрату від досліду першого додають 3-4 краплі концентрованого розчину аміаку — утворюється осад. Фосфорну кислоту визначають молібдатом амонію і аскорбіновою кислотою. Інтенсивність голубого кольору прямо пропорційна концентрації фосфору в плазмі крові.

Норма кальцію 2,1-2,55 ммоль/л, магнію — 0,82-0,94 ммоль/л, фосфору — 0,87-1,45 ммоль/л (в сироватці).

 

Тема заняття № 11. Дослідження білків плазми крові: білки гострої фази запалення, індикаторні ферменти, ліпопротеїни.

 

Цілі заняття:

ØПояснювати основні функції білків плазми крові на основі їх фізико-хімічних властивостей.

ØПояснювати діагностичне значення зростання вмісту білків гострої фази запальних процесів.

ØПояснювати молекулярно-біохімічні механізми змін вмісту в плазмі кров: секреторних і тканинних ферментів, атерогенних і антиатерогенних ліпопротеїнів.

ØПояснювати біохімічні основи функціонування систем регуляції тиску крові (калікреїн-кінінова та ренін-ангіотензивна системи) та науково обгрунтоване застосування гіпотензивних лікарських засобів — інгібіторів ангіотензин перетворюючого ферменту.

 

Теоретичні питання

1. Основні групи білків плазми крові, їх склад та вміст в нормі і при патології.

2. Фактори, що впливають на вміст білків у плазмі крові: гіпер- та гіпопротеїнемії.

3. Білки гострої фази запалення: С-реактивний білок, церулоплазмін, гаптоглобін, кріоглобулін, α1-антитрипсин, α2-макроглобулін, інтерферон. Їх діагностичне значення.

4. Ферменти плазми крові: власні (секреторні) та індикаторні(тканинні) ферменти.

5. Діагностичне значення дослідженя активності ферментів та ізоферментів плазми крові: креатинфосфокінази, ЛДГ, АсТ, АлТ, амілази, ліпази

6. Калікреїн-кінінова система, її біологічна роль.

7. Ліпопротеїни плазми крові:

· класифікація: ХМ, ЛПДНЩ, ЛППЩ, ЛПНЦ, ЛПВЩ.

· схема будови ліпопротеїнів;

· метаболізм та функціональне значення окремих класів ліпопротеїнів плазми крові.

· гіпер- і гіпопротеїнемії, їх види, прояви. Гіперліпопротеїнемія та атеросклероз.

· молекулярно-біохімічні механізми атеросклерозу.

8. Гіперліпопротеїнемія та гіперхолестеринемія - загроза розвитку атеросклерозу

9. Роль глутатіону в захисті від пероксидного окисленні ліпідів, вітаміни-антиоксиданти.

10. Залишковий азот плазми крові.

 

Практичні роботи

Завдання 1. Фракціонування білків плазми крові методом висолювання: визначення альбумінів і глобулінів плазми крові.

Принцип методу. Білки, в залежності від величини заряду і молекулярної ваги, з водного розчину осаджуються мінеральними, органічними кислотами та розчинами солей різної концентрації.

Хід роботи. В пробірку вносять 2 мл плазми крові, добавляють 2 мл 50% розчину сульфату амонію. Випадає осад — це глобуліни. У фільтраті залишились альбуміни, які осаджуються 100% насиченим розчином сульфату амонію.

Клініко-діагностичне значення. Осадження білків застосовують для виділення білків із тканин, виявлення їх у різних біологічних рідинах, розділення суміші білків.

Завдання 2. Визначенн типів ліпопротеїнів по вмісту в них холестерину.

Принцип методу. Співвідношення і вміст ліпопротеїнів може мінятися при патологічних станах, що дозволяє використов