Выделение чистой культуры анаэробов

I этап — обогащение на среде Китт-Тароцци, предварительно прокипяченной

в течение 30 минут. После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для

уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются.

II этап - получение изолированных колоний. На среде Китт-Тароцци

обнаруживается помутнение с пузырьками газа.

Ш этап - выделение чистой культуры проводится по одному из следующих

методов:

А) По Цейсслеру - каплю материала со среды Китт-Тароцци засевают в

чашку с кровяным агаром и распределяют материал шпателем, этим же

шпателем производят посев во второй и третьей чашках;

Б) По Вейнбергу - каплю материала со среды Китт-Тароцци переносят в

растопленный и слегка остуженный сахарный агар, затем набирают в трубки

Веньял-Вейона и инкубируют в термостате.

IV и V этапы - идентификация в реакции нейтрализации на белых мышах.

Заражение куриного эмбриона

Куриный эмбрион используется для культивирования вирусов, микоплазм. Используют эмбрионы в возрасте 8-14 дней в зависимости от вида вируса и способа заражения: на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полость, в желточный мешок. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушного мешка. Заражение куриных эмбрионов производят в боксе в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением.

1этап

Скорлупу над воздушным пространством протирают спиртом, обжигают в пламени, смазывают 2% раствором йода, снова протирают спиртом и обжигают. Вирусный материал в количестве 0,05 - 0,2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом или пастеровской пипеткой.

II этап

Вскрытие эмбрионов проводят через 48-72 часа инкубации в термостате. Наличие вируса в хорион-аллантоисной оболочке определяют:

1. по белесоватым непрозрачным пятнам разной формы;

2. в реакции гемагглютинации.

РГА

Реакция гемагглютинации- это один из методов индикации вирусов. Ставится двумя методами:

1) капельным на стекле;

2) в пробирках - развернутая реакция.

Компоненты:

1) исследуемый материал: аллантоисная жидкость, суспензия

хорионаллантоисной оболочки куриного эмбриона, экстракт из

культуры клеток, зараженных вирусом;

2) 5% взвесь куриных эритроцитов;

3) физиологический раствор.

На чистое обезжиренное стекло наносят 1 каплю взвеси эритроцитов и 1 каплю исследуемого материала.

При «+» результате - хлопья агглютинации эритроцитов.

Реакция фаголизиса

Реакция фаголизиса ставится для идентификации возбудителя дизентерии.

Постановка реакции:

1) чистая культура шигелл на скошенном агаре;

2) 2 пробирки с МПБ - «опыт» и «контроль»;

3) дизентерийный бактериофаг

На I этапе:

1) Проверка культуры шигелл на чистоту (окраска по Граму);

2) Посев в 2 пробирки с МПБ

3) В пробирку «опыт» добавить 2 капли (0,1 мл) дизентерийного

бактериофага;

4) Посевы инкубировать в термостате 18-20 часов при темпратуре 37°С

На II этапе:

1) Регистрация результатов посева

В пробирке «контроль» имеется равномерное помутнение МПБ, т.к. культура шигелл оказалась жизнеспособной. В пробирке «опыт» МПБ прозрачный, т.е. дизентерийный бактериофаг вызвал лизис одноименной культуры бактерий.

Определение фаготипа

Определение фаготипа проводится с помощью специальных наборов типовых фагов и является одним из методов внутривидовой дифференциации бактерий. Цели фаготипиривания:

1. Помощь эпидемиологу в выявлении источников и путей

циркуляции инфекции при внутрибольничном

заражении;

2. Для идентификации микроба.

Определение фаготипа стафилококка проводят при помощи фагов, разведенных до тест- разведения, обозначенного на этикетке. Каплю 4-х часовой бульонной культуры распределяют на поверхности подсушенного агара в чашке Петри. Дно чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов, затем капают фаги по одному в каждый квадрат. Посев инкубируют в термостате 18 часов* при температуре 37°С. На 2-й день проводят учёт результатов; фаготип культуры соответствует тому фагу, который в тест-разведении вызывает её полный лизис. В зависимости от чувствительности культуры к фагу наблюдается разная степень лизиса:

+ + + + - сплошной лизис

+ + + - сливной лизис с вторичным ростом

+ + - более 50 негативных колоний (стерильных пятен)

+ - единичные негативные колонии (стерильные пятна)

- лизиса нет

Также проводится фаготипирование брюшнотифозных (44 типа) и паратифозных бактерий (15 типов), энтеропатогенных эшерихий (24 типа).

Метод бумажных дисков

Биологическая активность антибиотиков выражается в международных единицах (ME). За единицу активности принимается то минимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма, определенного вида микроорганизма в строго определенных условиях. Степень чувствительности к антибиотикам необходимом определять для успешного проведения лечения. Наиболее распространен метод «бумажных дисков»: в чашку Петри с МПА «газоном» засевают взвесь изучаемой культуры микроба. На засеянную поверхность агара пинцетом накладывают бумажные диски, пропитанные антибиотиками. Диски располагают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии от края чашки 15 мм. Чашки выдерживают в термостате 18-20 часов при температуре 37 °С. Учёт результатов проводят на 2-ой день путем измерения зон задержки роста. Диаметр зоны задержки роста:
Меньше 10 мм - штамм устойчивый
11-15 мм - штамм малоустойчивый
15-25 мм - штамм чувствительный
больше 25мм - штамм высокочувствительный.

Учет результатов ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

В основе метода ПЦР лежит природный процесс — комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.

 

Способы учета результатов ПЦР:

Качественная оценка (электрофоретический метод)

Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ "да" или "нет", как, например, при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др. Обычным способом разделения продуктов ПЦР и идентификации специфического гена является электрофорез в агарозном или (реже) полиакриламидном геле. Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным - в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена. Положительный контроль может представлять собой целевую ДНК или участок гена, клонированный в плазмиде или амплифицированный с помощью ПЦР

Для учета результатов качественной ПЦР может быть использован и метод флуоресцентной детекции. Для этого по окончании ПЦР определяют наличие или отсутствие специфического сигнала с помощью специальных флуориметров (так называемый flash-метод). Поскольку здесь нет необходимости и в электрофоретическом оборудовании, то очевидна существенная экономия рабочих зон и реагентов для лаборатории.

 

Методы учета результатов ПЦР без применения электрофореза наиболее уместны и выгодны для многопрофильных лабораторий, где ПЦР-методы составляют лишь некоторую часть общего производственного процесса.

 

В таких крупных лабораториях часто определяется лишь ограниченный круг наиболее востребованных микроорганизмов. На российском рынке предлагается целый ряд flash-наборов для диагностики заболеваний, передающихся половым путем, и ряда вирусных инфекций. Этот ассортимент патогенов вполне достаточен для многих больничных лабораторий, и они могут с начала своей деятельности сделать акцент на подобных методах анализа.