Правила поведения в баклаюораториях

Правила поведения в баклаюораториях

a) В помещение лаборатории нельзя входить без специальной одежды: халата, тапочек, сменной обуви,

b) В лабораторию нельзя вносить посторонние вещи, запрещается курить и приносить пищу.

c) При распаковывании заразного материала необходимо соблюдать осторожность: пробирки снаружи обтирать дезинфицирующим раствором: переливание жидкостей, содержащих патогенные микробы, производят над сосудом, содержащим дезинфицирующий раствор.

d) Если разбилась посуда. Содержащая заразный материал (пробирка, чашка Петри), немедленно производится обеззараживание предметов, ©дежды, стола и помещения.

e) После окончания работы дезинфицируют руки и поверхность рабочего стола.

f) Музейные культуры микробов ставят на хранение в холодильник, закрывают и опечатывают.

g) Работники лаборатории подлежат обязательной вакцинации против тех инфекционных болезней, с возбудителями которых они работают. На кафедре микробиологии используются материалы, содержащие возбудителей III-IV групп, после разрешения председателя режимной комиссии Республиканской ГЭС.

Правила забора материала для микробиологических исследования

При заборе и работе с клиническим материалом персонал должен исполь­зовать перчатки и халат. Сроки доставки клинического материала в лаборато­рию должны быть сокращены до минимума.

Кровь для посева следует брать до начала антибактериальной терапии; на высоте подъема температуры; у постели больного с соблюдением правил асеп­тики. Посев производится в двойную и тиогликолевую среду в соотношении 1:10.

Моча для посева берется до начала антибактериальной терапии. Моча здо­рового человека стерильна. От начала взятия пробы мочи до начала исследова­ния в лаборатории должно проходить не более 1-2 часов.

Гной получают с помощью стерильного шприца или стерильного ватного тампона.

Испражнения на патогенные энтеробактерии берут ректальными петлями, смоченными консервантом, и помещают в пробирку с консервирующей средой.

Слизь из носоглотки (на дифтерию) забирают стерильным тампоном натощак. Тампон помещают в стерильную пробирку и доставляют в лабораторию не позже 2-3 часов с момента забора материала.

Спинно-мозговую жидкость получают в результате люмбальной пунк­ции. 3-5 мл ликвора помещают в пробирку (при транспортировке предохранять от охлаждения).

Мокроту собирают натощак после ополаскивания рта в стерильную посуду

 

Правила забора материала, хранения и транспортировке при ООИ

К особо опасным инфекциям прежде всего относится чума. При постанов­ке предварительного диагноза «чума» в лаборатории проводятся срочные мероприятия:

1. Немедленно сообщают 8 вышестоящие органы здравоохранения,

2. На лабораторию накладывается карантин, т.е. ни один лабораторный работник, контактировавший с заразным материалом, не должен покидать поме­щения лаборатории до прибытия эпидемиолога.

3. Все материалы: от больных, чистые культуры и павшие животные долж­ны быть направлены в специализированные лаборатории для окончательного установления диагноза.

Подготовка посуды к стерилизации

В бактериологических и вирусологических лабораториях используют обычную лабораторную посуду: цилиндры, колбы, склянки для растворения и хранения реактивов, химические пробирки. Помимо этого используют специ­альную посуду:

Пробирки

• биологические- с крупным дном, неразвернутым краем;

• центрифужные- сужены книзу, конической формы;

• преципитацию иные- очень узкие с внутренним диаметром 2-3 мм Стеклянные чашки Петри для выращивания микроорганизмов на плотных питательных средах. Их изготавливают из прозрачного стекла, не имеюще­го камней, пузырей. Высота чашки 20-30 мм, диаметр 60-200 мм

Пипетки

• градуированные должны соответствовать параметрам ГОСТа

• пастеровские- стеклянные трубки диаметром 5-7 мм, у которых один конец оттянут над пламенем горелки в виде капилляра

Специальная лабораторная посуда должна быть чистой и стерильной. Мытье производят ершами с мылом и содой. Новую посуду следует до мытья прокипятить в 1-2% растворе хлористоводородной кислоты. Сушат посуду в су­шильном шкафу

Сухую посуду закрывают и помещают в пеналы. В пробирки вставляют ватные пробки и заворачивают в пачки по 5-10 штук. К чашкам Петри подбирают крышки и завертывают по одной или несколько штук. Пипетки закрывают ваткой с того конца, который берут в руки. Готовые пипетки заворачивают в бумагу и укладывают в пеналы. Стерилизация проводится в сухожаровом шкафу при температуре 180°С в течение 1 часа.

Этапы приготовления мазка

Для приготовления мазка необходимо иметь:

• Чистое обезжиренное предметное стекло.
• Бактериологическую петлю
• Культуру, выращенную на плотной питательной среде — агаре, или жидкой среде — бульоне.
• Спиртовку.
• Набор красок.

1. Обезжиренное предметное стекло и бактериологическую петлю прожигают в пламени горелки. Пробирку с изучаемой культурой держат между указательным и большим пальцами левой руки. Петлю берут правой рукой, мизинцем правой руки прижимают пробку пробирки к ладони.

Если мазок готовится с жидкой питательной среды, то каплю культуры на­носят петлей на предметное стекло.

Если мазок делают из культуры с агара, то петлю с культурой вносят на предметное стекло и добавляют каплю физиологического раствора, в котором эмульгируют внесенный материал.

Петлю обжигают в пламени горелки. Мазок должен быть тонким, рав­номерно растертым, округлой формы, размером 1,5-2 см.

2. Высушивание мазка производится при комнатной температуре.

3. Фиксация мазка производится с целью:

• Убить микробные клетки.
• Обеспечить лучшее прилипание микробов к предметному стеклу.
• Облегчить дальнейшее окрашивание.

Фиксация мазка в пламени горелки производится 3-кратно, действие пла­мени должно длиться 2 секунды.

Для более нежной фиксации мазков крови, спирохет и простейших использующих химические фиксаторы:

• Метиловый спирт в течении 5-и минут.
• Этиловый спирт (96°) в течении 10-и минут.
• Смесь Никифорова — в течении 10-15 минут.
• Ацетон — в течении 5-и минут.
• Пары формалина — в течении нескольких секунд.

4. Окраска препаратов проводится:

• Простыми методами (водным фуксином Пфейффера, метиленовой синькой Леффлера), когда окрашивается вся клетка и используется только один краситель;
• Сложными методам, когда определяются клеточные структуры,

После экспозиции мазок промывают водой, высушивают фильтроваль­ной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

8) Основные правила микроскопии (микроскопия готовых препаратов)

Световой микроскоп — это обязательная принадлежность любой микробиологической лаборатории. Разрешающая способность светового микроскопа 0,2 мкм. Общее увеличение микроскопа определяется произведением объекта на увеличение окуляра.

Микроскопия с сухими объективами дает увеличение в 120-600 раз. Не­достаток: часть лучей отклоняется в сторону и не достигается

хорошее освещение изучаемого объекта. Иммерсионные объективы — это объективы, которые погружают в жидкости (кедровое масло, персиковое мас­ло). Поскольку показатели преломления стекла и иммерсионного масла практи­чески одинаковы 1,52, сохраняется четкость и ясность поля зрения. Полезное увеличение микроскопа достигает 2000 раз. Современный микроскоп — это точ­ный оптический прибор, поэтому необходимо строго соблюдать ряд правил при работе с ним:

1) использовать правильное освещение;

2) хранить закрытым от пыли;

3) для чистки оптических частей применять кисточку или мягкую ткань, смоченную водой или спиртом. Раз в год микроскоп должен просматривать мастер-оптик.

Метод грамма

Метод Грама введен в 1884 году датским микробиологом Гансом Христианом Грамом и является важным таксономическим признаком.

К грамположительным бактериям относятся те, у которых комплекс, образуемый генцианвиолетом и йодом, удерживается при обработке спиртом.

Грамотрицательными называют те бактерии, которые не обладают свойством удерживать комплекс и обесцвечиваются при обработке спиртом.

Способность или неспособность клеток удерживать комплекс генцианвеолета с йодом связывают с различным составом и структурой клеточной стенки бактерий.

Методика окраски.

1.На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, пропитанную генцианвиолетом и наносят каплю воды на 2 минуты. Генцианвиолет основная краска.

2. Бумагу сбрасывают и, не промывая водой, наливают раствор Люголя на 1 минуту. Раствор Люголя протрава: усиливает действие основной краски у грамположительных бактерий.

3. Препарат обесцвечивают 3-5 каплями спирта в течение ЗОсекунд до прекращения отхождения фиолетовых струек краски. Спирт обесцвечивающий фактор.

4. Промывают водой.

5. Докрашивают водным фуксином Пфейффера в течение 1-2 минут. Водный фуксин дополнительная краска. Грамположитель-ные бактерии (кокки) сине-фиолетового цвета, грамотрицательные (палочковидные формы) розового цвета.

6. Промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

Метод Циль-Нильсена

Метод используется для окраски спор и кислотоустойчивых бактерий (микобактерии туберкулеза). Кислотоустойчивость связана с наличием в клеточной стенке мяколовых кислот. Метод Циль-Нильсена основан на использовании концентрированных красителей прогревания.

Методика окраски:

1. На фиксированный мазок накладывают белую фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля. Препарат 2-3 раза подогревают в в пламени до появления паров.	Карболовый фуксин-основная краска; прогревание-протрава.
2. Препарат промывают водой, бумагу сбрасывают.
3. Препарат обесцвечивают в 5% растворе серной кислоты.	Серная кислота-обесцвечивающий фактор.
4. Промывают водой
5. Докрашивают синькой Леффлера 3-5 минут	Синька Леффлера — дополнительная краска
6. Промывают водой, высушивают, смотрят под иммерсией	Кислотоустойчивые бактерии и споры рубиново- красного цвета, а остальная микрофлора — синего цвета

Метод «раздавленной капли»

Культуру в изотоническом растворе хлорида натрия наносят на предмет­ное стекло и сверху накладывают покровное. Капля материала должна быть та­кой величины, чтобы она заполняла все пространство между покровным и предметным стеклом и не выступала за пределы покровного. Препарат рас­сматривают с иммерсионной системой и слегка опущенным конденсором.

Метод «висячей капли»

Необходимо иметь предметное стекло с лупочкой. Каплю культуры нано­сят на покровное стекло, сверху накладывают предметное стекло с лупочкой посредине, края которого предварительно обмазаны вазелином. Затем предмет­ное стекло слегка прижимают к покровному, и препарат переворачивают по­кровным стеклом кверху. Получается герметично закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

Химические методы

1. Прибор Омелянского — для поглощения кислорода используется пиро­галлол.

2. Среда Вильсон — Блера. Содержит глюкозу, сернисто-кислый натрий, хлорид железа. Анаэробы образуют черные колонии за счет восстановления сернисто-кислого натрия в сернистый натрий, который, соединяясь с хлоридом железа, образуют осадок черного цвета -сернистое железо.

Метод дригальского

Метод Дригальского основан на механическом разобщении на поверхности плотной, питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуемого материала.

I этап.

1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовление

мазка* окраска по Граму). v

2. Посев на чашку Петри: одну каплю материала наносят на поверхность

МПА и растирают шпателем. Не обжигая шпателя и не набирая нового

материала, засевают вторую и третью чашки.

3. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате

18-20 часов при температуре 37°С.

II этап.

1. Макроскопическое изучение колоний по величине, форме, окраске,

характеру поверхности, краев, консистенции..

2. Микроскопическое изучение одной исследуемой колонии (приготовление

мазка, окраска по Граму).

3. Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирку со скошенным агаром.

4. Пробирку инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37°С.

III этап.

Проверка культуры на чистоту (макроскопическим - однородный рост, микроскопическим — однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признаками клетки).

IV этап.

Идентификация проводится по:

- ферментативным свойствам.

- антигенным свойствам, токсигенности и другим признакам

- фагочувствительности

Заражение куриного эмбриона

Куриный эмбрион используется для культивирования вирусов, микоплазм. Используют эмбрионы в возрасте 8-14 дней в зависимости от вида вируса и способа заражения: на хорион-аллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полость, в желточный мешок. Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушного мешка. Заражение куриных эмбрионов производят в боксе в строго асептических условиях, пользуясь инструментом, стерилизованным кипячением.

1этап

Скорлупу над воздушным пространством протирают спиртом, обжигают в пламени, смазывают 2% раствором йода, снова протирают спиртом и обжигают. Вирусный материал в количестве 0,05 - 0,2 мл наносят на хорион-аллантоисную оболочку туберкулиновым шприцом или пастеровской пипеткой.

II этап

Вскрытие эмбрионов проводят через 48-72 часа инкубации в термостате. Наличие вируса в хорион-аллантоисной оболочке определяют:

1. по белесоватым непрозрачным пятнам разной формы;

2. в реакции гемагглютинации.

РГА

Реакция гемагглютинации- это один из методов индикации вирусов. Ставится двумя методами:

1) капельным на стекле;

2) в пробирках - развернутая реакция.

Компоненты:

1) исследуемый материал: аллантоисная жидкость, суспензия

хорионаллантоисной оболочки куриного эмбриона, экстракт из

культуры клеток, зараженных вирусом;

2) 5% взвесь куриных эритроцитов;

3) физиологический раствор.

На чистое обезжиренное стекло наносят 1 каплю взвеси эритроцитов и 1 каплю исследуемого материала.

При «+» результате - хлопья агглютинации эритроцитов.

Реакция фаголизиса

Реакция фаголизиса ставится для идентификации возбудителя дизентерии.

Постановка реакции:

1) чистая культура шигелл на скошенном агаре;

2) 2 пробирки с МПБ - «опыт» и «контроль»;

3) дизентерийный бактериофаг

На I этапе:

1) Проверка культуры шигелл на чистоту (окраска по Граму);

2) Посев в 2 пробирки с МПБ

3) В пробирку «опыт» добавить 2 капли (0,1 мл) дизентерийного

бактериофага;

4) Посевы инкубировать в термостате 18-20 часов при темпратуре 37°С

На II этапе:

1) Регистрация результатов посева

В пробирке «контроль» имеется равномерное помутнение МПБ, т.к. культура шигелл оказалась жизнеспособной. В пробирке «опыт» МПБ прозрачный, т.е. дизентерийный бактериофаг вызвал лизис одноименной культуры бактерий.

Определение фаготипа

Определение фаготипа проводится с помощью специальных наборов типовых фагов и является одним из методов внутривидовой дифференциации бактерий. Цели фаготипиривания:

1. Помощь эпидемиологу в выявлении источников и путей

циркуляции инфекции при внутрибольничном

заражении;

2. Для идентификации микроба.

Определение фаготипа стафилококка проводят при помощи фагов, разведенных до тест- разведения, обозначенного на этикетке. Каплю 4-х часовой бульонной культуры распределяют на поверхности подсушенного агара в чашке Петри. Дно чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов, затем капают фаги по одному в каждый квадрат. Посев инкубируют в термостате 18 часов* при температуре 37°С. На 2-й день проводят учёт результатов; фаготип культуры соответствует тому фагу, который в тест-разведении вызывает её полный лизис. В зависимости от чувствительности культуры к фагу наблюдается разная степень лизиса:

+ + + + - сплошной лизис

+ + + - сливной лизис с вторичным ростом

+ + - более 50 негативных колоний (стерильных пятен)

+ - единичные негативные колонии (стерильные пятна)

- лизиса нет

Также проводится фаготипирование брюшнотифозных (44 типа) и паратифозных бактерий (15 типов), энтеропатогенных эшерихий (24 типа).

Метод бумажных дисков

Биологическая активность антибиотиков выражается в международных единицах (ME). За единицу активности принимается то минимальное количество антибиотика, которое задерживает рост стандартного штамма, определенного вида микроорганизма в строго определенных условиях. Степень чувствительности к антибиотикам необходимом определять для успешного проведения лечения. Наиболее распространен метод «бумажных дисков»: в чашку Петри с МПА «газоном» засевают взвесь изучаемой культуры микроба. На засеянную поверхность агара пинцетом накладывают бумажные диски, пропитанные антибиотиками. Диски располагают на равном расстоянии друг от друга и на расстоянии от края чашки 15 мм. Чашки выдерживают в термостате 18-20 часов при температуре 37 °С. Учёт результатов проводят на 2-ой день путем измерения зон задержки роста. Диаметр зоны задержки роста:
Меньше 10 мм - штамм устойчивый
11-15 мм - штамм малоустойчивый
15-25 мм - штамм чувствительный
больше 25мм - штамм высокочувствительный.

Учет результатов ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации ДНК in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

В основе метода ПЦР лежит природный процесс — комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы. Эта реакция носит название репликации ДНК.

 

Способы учета результатов ПЦР:

Качественная оценка (электрофоретический метод)

Во многих случаях при ПЦР-диагностике достаточно получить ответ "да" или "нет", как, например, при первичном выявлении инфекционных возбудителей, судебно-медицинских исследованиях, определении генных мутаций, специфических онкогенов и др. Обычным способом разделения продуктов ПЦР и идентификации специфического гена является электрофорез в агарозном или (реже) полиакриламидном геле. Методики электрофоретического разделения достаточно стандартизированы и дают вполне воспроизводимые результаты. Результат должен быть безусловно отрицательным в контроле без изучаемой ДНК и положительным - в пробе с ДНК, содержащей искомый участок гена. Положительный контроль может представлять собой целевую ДНК или участок гена, клонированный в плазмиде или амплифицированный с помощью ПЦР

Для учета результатов качественной ПЦР может быть использован и метод флуоресцентной детекции. Для этого по окончании ПЦР определяют наличие или отсутствие специфического сигнала с помощью специальных флуориметров (так называемый flash-метод). Поскольку здесь нет необходимости и в электрофоретическом оборудовании, то очевидна существенная экономия рабочих зон и реагентов для лаборатории.

 

Методы учета результатов ПЦР без применения электрофореза наиболее уместны и выгодны для многопрофильных лабораторий, где ПЦР-методы составляют лишь некоторую часть общего производственного процесса.

 

В таких крупных лабораториях часто определяется лишь ограниченный круг наиболее востребованных микроорганизмов. На российском рынке предлагается целый ряд flash-наборов для диагностики заболеваний, передающихся половым путем, и ряда вирусных инфекций. Этот ассортимент патогенов вполне достаточен для многих больничных лабораторий, и они могут с начала своей деятельности сделать акцент на подобных методах анализа.

 

РА на стекле

Реакция агглютинации на предметном стекле используется для ускоренной постановки диагноза (идентификации аозбу-дитепя). Для этого на предметном стекле пастеровской пипеткой наносят каплю диагностической сыворотки и рядом на том же стекле помещают каплю физиологического раствора для контроля. Петлёй снимают небольшое количество исследуемого материала бактерий (можно брать бактерии из колоний на чашке, со скошенного агара) и вносят их в каплю сыворотки; размешивают до получения равномерной мути. Второй же комочек микробной массы размешивают в капле физиологического раствора. Через несколько минут при положительной реакции агглютинации в капле с сывороткой появляются хлопья, видимые на глаз на темном фоне, тогда как контрольная капля остаётся равномерно мутной. Мы работаем с брюшнотифозными сыворотками и соответствующими культурами.

Реакция широко применяется для серологической идентификации

выделенных микробов, а также при постановке ускоренных серологических

реакций.

Постановка реакции:

Пастеровской пипеткой наносят на предметное стекло каплю сыворотки в

нужных разведениях. В каждую каплю сыворотки вносят петлю 24-часовой

агаровой живой культуры или каплю диагностикума. Постановка реакции

должна сопровождаться контролем антигена и контролем сыворотки. Учет

реакции производят через 5-10 минут.

Компоненты:

1. Антигены неизвестного вида;

2. Известная иммунная сыворотка;

3. Физиологический раствор.

РА Видаля

Реакция агглютинации широко применяется в лабораторной практике для серодиагностики. Реакция агглютинации протекает в две фазы:

1 фаза - соединение антигена с антителом;

2 фаза - адсорбция на комплексе антиген+антитело физиологического

раствора и выпадение осадка двух видов:

а) крупнохлопчатого - у жгутиковых бактерий (Н-агглютинация);

б) мелкозернистого - агглютинат образуется в виде компактных зерен

(О-агглютинация).

Компоненты реакции Видаля:

 

1) испытуемая сыворотка в разведениях 1:100, 1:200, 1:400, 1:800,

1:1600;

2) диагностикумы - взвесь убитых сальмонелл трех видов: брюшного

тифа, паратифа А и В;

3) физиологический раствор.

Цель реакции: определение титра антител в испытуемой сыворотке.

Реакция агглютинации должна сопровождаться контролем антигена и сыворотки. Реакция ставится в трех рядах. Учет результатов проводят через 18-20 часов.

Степень положительной реакции агглютинации обозначается плюсами: + + + + полная агглютинация + + + неполная агглютинация + + слабая агглютинация - осадка нет (отрицательная реакция) б) реакция Вейгля

Ставится с 8 дня болезни при сыпном тифе и болезни Брилля-Цинссера для обнаружения антител в испытуемой сыворотке крови. Компоненты реакции Вейгля:

1) испытуемая сыворотка в разведениях 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800;

2) риккетсиозный диагностикум - взвесь убитых риккетсий Провачека

3) физиологический раствор

Реакция применяется при рецидивах эпидемического сыпного тифа (болезни Брилля-Цинссера), обусловленных реактивацией риккетсий Провачека в сыпнотифозных гранулемах.

Специфические антитела (агглютинины) обнаруживаются в крови больного со 2-ой недели болезни. Для постановки реакции Видаля берут шприцем кровь из локтевой вены в количестве 2-3 мл и дают ей свернуться. Образовавшийся сгусток отделяют, а сыворотку отсасывают в чистую пробирку и готовят из неё 3 ряда разведений сыворотки больного от 1:100 до 1:800 следующим образом: во все пробирки разливают по 1 мл (20 капель) физиологического раствора; затем этой же пипеткой наливают 1 мл сыворотки, разведенной 1:50 в первую пробирку, перемешивают с физиологическим раствором, таким образом получают разведение 1:100, Из этой пробирки переносят 1 мл сыворотки в следующую пробирку, перемешивают с физиологическим раствором, получают разведение 1:200 также получают разведения 1:400 и 1:800 в каждом из трёх рядов. Реакция агглютинации Видзля ведётся в объеме 1 мл жидкости, поэтому из последней пробирки после смешения жидкости удаляют 1 мл. В отдельную контрольную пробирку наливают 1 мл физиологического раствора без сыворотки. Этот контроль ставится для проверки возможности спонтанной агглютинации антигена (диагностикума) а каждом ряду {контроль антигена). Во все пробирки каждого ряда, соответствующего надписям, закапывают по 2 капли диагностикума. Штатив ставят в термостат на 2 часа при 37 «С и затем на сутки оставляют при комнатной температуре. Учёт реакции производится на следующем занятии.

В сыворотках больных могут быть как специфические, так и групповые антитела, которые различаются по высоте титра. Специфическая реакция агглютинации идёт обычно до более высокого титра. Реакция считается положительной, если агглютинация произошла хотя бы в первой пробирке с разведением 1:200. Обычно она наступает в больших разведениях. Если наблюдается групповая агглютинация с двумя или тремя антигенами, то возбудителем болезни считают того микроба, с которым произошла агглютинация в наиболее высоком разведении сыворотки.

Недостатки реакции:

1. реакция положительна, начиная со 2-ой недели заболевания;

2. реакция положительна в 3-х случаях: у больных (инфекционная реакция), у переболевших (анамнестическая) и у вакцинированных (прививочная).

Для дифференциации реакций прибегают к повторной постановке ее через 5-6 дней. У больных отличается резкое нарастание титра антител При прививочной и анамнестической реакциях титр антител не изменится.

Реакцию Видаля можно поставить одновременно с Н- и О-антигенами бактерий брюшного тифа, что помогает дифференцировать инфекционную реакцию от прививочной, так как у привитых обнаруживаются только Н-антитела, О-агглютинин в высоком титре отмечается только в разгар болезни.

РА Райта

Реакция агглютинации является одним из основных методов диагностики бруцеллеза у людей. Наибольшую диагностическую ценность реакция агглютинации представляет при острой и подострой форме бруцеллеза.

Техника постановки реакции.

В пробирки разливают физиологический раствор: в первую - 2,4 мл, в остальные по 0,5 мл. В первую пробирку добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки, перемешивают, переносят 0,5 мл в третью пробирку и т.д. Из последней пробирки 0,5 мл смеси выливают, в результате получают в каждой пробирке по 0,5 мл следующих разведений 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. Из первой пробирки 0,5 мл переносят в чистую пробирку и добавляют туда 0,5 мл физиологического раствора (контроль сыворотки в разведении 1:50), а 1,0 мл выливают.

Диагностикум разводят физиологическим раствором согласно прилагаемому к нему наставлению и добавляют по 0,5 мл во все пробирки, кроме контроля. После добавления диагностикума разведение сыворотки соответственно удваивается, т.е. получается 1:50, 1:100 и т.д. Сыворотки с антигеном смешивают путем встряхивания и помещают в термостат (37 °C) на 18 - 20 часов. После инкубации пробирки выдерживают 1 - 2 часа при комнатнойтемпературе и проводят учет реакции.

Учет реакции проводят по стандарту мутности в зависимости от степени осаждения агглютината и просветления жидкости.

Для приготовления стандарта мутности антиген, применяемый для постановки РА, еще раз разводят в два раза.

Дальнейшее разведение антигена физиологическим раствором производят по схеме 1.

 

 

РАЗВЕДЕНИЕ АНТИГЕНА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИМ РАСТВОРОМ

	Степень агглютинации
++++	+++	++	+
Антиген, разведенный 1:2		0,25	0,5	0,75	1,0
Физ. раствор	1,0	0,75	0,5	0,25
% просветления

Стандарт мутности готовят каждый раз при постановке РА и ставят в термостат одновременно с основной реакцией.

Титром сыворотки является максимальное ее разведение, дающее 50% агглютинации, - просветление, оцениваемое на 2+.

При применении стандартизированного диагностикума титры исследуемых сывороток соответствуют количеству международных единиц антител (ме/мл).

Так, титры 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. соответственно равны 50, 100, 200 и т.д. ме/мл.

При диагностической оценке РА рекомендуется следующая схема:

- титр сыворотки 1:100 (100 ме/мл) - результат положительный;

- титр сыворотки 1:200 (200 ме/мл) - результат положительный;

- титр сыворотки 1:400 (400 ме/мл) - результат резко положительный.

Диагностическим титром принято считать реакцию агглютинации не менее 2+ при разведении сыворотки 1:100 и выше.

Недостатком реакции агглютинации признают также необходимость частых кровопусканий у животных, что создаёт почти непреодолимые трудности при реализации этого метода в крупных хозяйствах, в особенности У овец и свиней. У последних неудобство усугубляется тем, что изъятие крови производят из хвоста.

 

РПГА

Антитоксический противодифтерийный иммунитет проверяют с помощью РПГА с дифтерийным эритроцитарным диагностикумом (анатоксином).

Неимунными считаются лица с титром антитоксина менее 0,03 МЕ/мг

Ингредиенты:

1. Испытуемая сыворотка, адсорбированная бараньими эритроцитами;

2. Эритроцтарный диагностикум;

3. Физиологический раствор;

4. Противодифтерийная контрольная сыворотка активностью 10 ME.

Постановка реакции:

 

1) Сыворотку разводят физиологическим раствором в 12 лунках от

1:10 до 1:20480(1:40-1:5120)

2) В каждую лунку добавляют по 1 капле диагностикума;

3) Противодифтерийную контрольную сыворотку разводят также от

1:10 до 1:20480 и вносят по 1 капле диагностикума;

4) Оставляют на 3 часа при комнатной температуре.

РА по Асколи

Реакция Асколи ставится для диагностики сибирской язвы с целью обнаружения антигена сибиреязвенных бацилл. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь: преципитиноген — гаптен B. Antrachis (экстракт из тканей), преципитин (преципитирующая сибиреязвенная сыворотка) и физиологический раствор.

Приготовление термопреципитиногена.
1. 8 колбочку, содержащую 1 г измельчённой кожи или 1 мл культуры В. ап1Ьгас!3, налить 10 мл физиологического раствора.
2. Колбу поместить в кипящую баню на 30-45 минут.
3. Просрильтровать через асбестную эату. Фильтрат должен быть совершенно прозрачен.
Для реакции преципитации фильтрат разводится в 100 раз и более.

Постановка реакции кольцепреципитации.
1) В преципитэционную пробирку наливается 0,3 мл пре-ципитирующей сыворотки цельной или в разведении 1:5, 1:10.
2) По стенке пробирки осторожно наслаивается преципи-тиноген-
Реакция считается положительной, если на границе двух жидкостей образуется мутное кольцо выпадающего белка не позднее 5-15 минут.

При постановке реакции преципитации применяют следующие контроли:
а) антиген и физиологический раствор;
б) специфическая сыворотка и физ. раствор;
в) антиген и неспецифическая сыворотка.

Во всех контрольных пробирках помутнения не должно быть Для реакции преципитации пользуются специальными преципитационными пробирками высотой 40-60 мм и диаметром 4-5 мм, преципитация в узких пробирках наступает значительно скорее и проявляется более чётко, чем в обычных пробирках, их тщательно моют и высушивают, чтобы стекло их было совершенно прозрачным и сухим.

РСК Борде-Жангу

Реакция ставится для диагностики хронической гонореи с целью обнаружения антител к гонококку.

В РСК участвуют 2 системы: основная система — испытуемая сыворотка, антиген, комплемент и вспомогательная, индикаторная или гемолитическая система — гемолитическая сыворотка и эритроциты барана.

Если в первой системе образуются специфический комплекс антиген + антитело, то комплемент адсорбируется (соединяется с этим комплексом) и гемолиза во второй системе не происходит.

Для реакции требуется:

1. Испытуемая сыворотка, которая получается из крови, взятой пункцией локтевой вены больного. После свёртывания крови сыворотка отсасывается в отдельную пробирку и инакти-вируется 30 минут при 56 °С на водяной бане.

2. Антиген — взвесь убитых гонококков.

3. Эритроциты барана получают из стерильно взятой де-фибринированной крови. Их отмывают, центрифугируя 3 раза с новыми порциями физиологического раствора. В реакции используют 3 %-ю взвесь эритроцитов.

4. Гемолитическая сыворотка готовится заранее путём иммунизации кроликов эритроцитами барана. Перед употреблением производится титрование сыворотки.

5. Комплемент — свежая сыворотка морской свинки. Из сердца морской свинки шприцем насасывается кровь, после свёртывания отделяется сыворотка. Перед опытом вытитровы-вается рабочая доза комплемента. Для этого берут основное разведение комплемента 1:10 и разливают его по пробиркам от 0.1 до 0,5, после чего объем в каждой пробирке доводят физиологическим раствором до 1,5 мл.

Одновременно заготавливают гемолитическую систему -разведенная в тройном титре, гемолитическая сыворотка + 3 % взвесь эритроцитов барана. Оба ингредиента в разных объемах и выдерживают в термостате 30 минут (сенсибилизация смеси), после чего смесь добавляют по 1 мл в пробирки и помещают в термостат на 30 минут. Контролем служат 2 пробирки:

1. 1 мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора;

2. 0,5 мл комплемента 1:10 + 0,5 мл взвеси эритроцитов + 1,5 мл физиологического раствора.

Титром комплемента называется его минимальное количество, при котором ещё происходит гемолиз. Для постановки реакции берут рабочую дозу комплемента, увеличенную против титра на 20-25 %, т.е., обычно то количество комплемента, которое имеется в предпоследней пробирке с гемолизом. Увеличение дозы комплемента необходимо потому, что в реакции активность комплемента может оказаться несколько подавленной другими ингредиентами реакции (антиген, сыворотка).

РСК Вассермана

Ставится для диагностики сифилиса с целью обнаружения антител, а также для определения эффективности специфической терапии. Она основана на принципе реакции связывания комплемента Борде-Жангу. Существенным отличием реакции Вассермана является неспецифичность антигена: в качестве антигена употребляют липоидные экстракты из нормальных органов животных

Для постановки реакции Вассермана необходимо иметь сыворотку больного, диагностикумы перекрестнореагирующие антигены № 1, № 2, комплемент, гемолитическую сыворотку, эритроциты барана, физиологический раствор.

Диагностикум № 1 — специфический, трепонемный.

Диагностикум № 2 — неспецифический, кардиолипиновый антиген, которые представляют собой высокоочищенные экстракты бычьего сердца, имеющие постоянный химический состав липоидов. Липоиды, экстрагированные из сердца, по химическому составу близки к липоидам бледной трепонемы, поэтому, хотя и не являются специфическими, но фиксируют антитела против спирохеты.

Указанные антигены выпускаются централизованно и в реакцию употребляются разведёнными согласно титру, указанному на этикетке.

Одновременно с основным опытом ставят 2 контроля: с заведомо отрицательной и с заведомо положительной сыворотками.

Постановка основного опыта