Методы индикации ТХ, используемые в войсковых средствах химической разведки и контроля

 

В принципе, любая молекула любого вещества, где бы она ни находилась, непрерывно сигнализирует о своем присутствии. Эта сигнализация осуществляется путем взаимодействия с окружающей средой, с другими молекулами и электромагнитным излучением. Действительно, за счет Броуновского движения она соударяется со своими «соседками», деформируясь при этом сама и деформируя их; за счет вращательно-колебательных движений ядер, входящих в состав её атомов и электронов, она создает вокруг себя переменное электромагнитное поле, способное взаимодействовать с различного вида излучениями.

Естественно, сигналы единичной молекулы ничтожно малы, но, когда число молекул оказывается достаточно большим (а это практически имеет место всегда), мы можем воспринимать эту сигнализацию, «проявлять» ее, зафиксировав тем или иным способом. Это оказывается возможным на основании использования особенностей взаимодействия электромагнитных излучений с веществом, которое проявляется как в поглощении излучения, так и в изменении состояния молекул вещества.

Изменение состояния молекулы происходит при поглощении молекулой кванта энергии, достаточного для переведения ее на более высокий энергетический уровень. Именно эти положения и определяют возможность индикации, т.е. регистрацию молекул анализируемых веществ одним из двух способов: или по изменению возбуждающего электромагнитного излучения, или по изменению состояния (состава и свойств) самих молекул. Изменение состава и свойств молекул, обеспечивающее возможность индикации, происходит и в результате химических реакций.

Особенности объектов анализа - молекул токсичных веществ - позволяют использовать для их регистрации третий способ по проявлению ими физиологической или биохимической активности.

Биохимический метод

Особенности свойств ТХ приводят к тому, что в отличие от малотоксичных соединений, их регистрация может осуществляться с высокой чувствительностью и специфичностью по проявлению биохимической и физиологической активности. Действительно, высокая степень токсичности веществ обусловила попытки использовать для их своевременного обнаружения «биохимический» метод индикации, в котором в роли «индикатора» выступают живые организмы. Этот метод находит широкое применение в работе научно-исследовательских лабораторий и полигонов (как в качестве самостоятельного средства анализа, так и для подтверждения данных химического контроля). На некоторых предприятиях, связанных с получением или переработкой общеядовитых ТХ, в качестве средства биоконтроля используются различные мелкие животные (белые мыши, канарейки, рыбы), которые обладают большей чувствительностью к действию ТХ. Последнее обусловлено тем, что с уменьшением размеров животного объем тела (и, следовательно, общий объем крови) уменьшается пропорционально кубу, а поверхность легких - квадрату линейных величин. В связи с этим гибель подобных животных наступает при тех дозах ТХ, при которых высшие организмы (человек) еще не получают серьезных поражений и, таким образом, могут быть предупреждены о возможном поражении.

Поскольку смертельные концентрации ТХ, приводящие к поражению в короткие сроки, создаются только в районе цели, во всех остальных случаях может оказаться достаточно эффективным принятие мер защиты при появлении первых симптомов поражения. Для некоторых ТХ (особенно имеющих скрытый период действия) проявлению первых симптомов поражения предшествует появление характерного для большинства ТХ запаха. Обнаружение ТХ по первым симптомам поражения и по запаху относится также к методам индикации ТХ по их физиологической или биохимической активности.

Возможности этих способов обнаружения ТХ иллюстрируются данными, представленными в таблице 1.2.

 

 

Таблица 1.2 – Возможности определения ТХ по их физиологическому действию

 

ТХ	Симптомы поражения	Время появления первых симптомов	Определение ТХ по запаху
Сmin., определя-емая по запаху, мг/л	характер запаха
Зарин	Чувство тяжести в груди, миоз, ухудшение зрения	От 30 с до нескольких мин	0,005	Фрукты
VХ	То же	То же	-	-
Синильная кислота	Металлический привкус во рту, раздражение в горле, головокружение	То же	0,001	Горький миндаль
Хлорциан	То же, а также резь в глазах и носоглотке, слезотечение	То же	0,0025	-
Фосген	Слабое раздражение верхних дыхательных путей	Скрытый период от 4 до 6 ч	0,005	Прелое сено
Люизит	Жжение кожи, чихание, кашель, слезоточение	От 1 до нескольких мин	0,0008	Герань
Иприт	-	Скрытый период от 2 до 6 ч	0,002	Горчица, чеснок
Хлораце-тофенон	Жжение и резкая боль в глазах	Несколько секунд	0,00025	Чере-муха
Адамсит	Жжение и боль в носо-глотке, боль за грудиной	Несколько минут	-	-
CS	То же, что и хлорацетофенон и адамсит	Несколько секунд	-	-

 

 

Закономерным развитием биологического метода индикации является переход к биохимическому методу, основанному на использовании для целей индикации тех извлеченных из организма жизненно важных элементов, воздействие на которые ТХ является первопричиной поражения.

В настоящее время хорошо известно, что этими элементами являются ферменты, однако широкое внедрение ферментативных реакций в практику индикации тормозится рядом специфических особенностей строения, свойств и методов выделения последних. Трудности, встречающиеся на этом пути, преодолены только для небольшого числа ферментов, что и определяет относительно малый удельный вес использования в индикации биохимического метода.

При этом следует иметь в виду, что в целях индикации целесообразно использовать только такие ферментативные реакции, которые могут дать существенный выигрыш в чувствительности по сравнению с химическими и физико-химическими методами. Последнее наиболее характерно для веществ высокотоксичных, причем с ростом токсичности ТХ закономерно увеличивается чувствительность его определения ферментативными реакциями.

Суммируя все вышеизложенное, можно сформулировать необходимые условия применения ферментов в индикации:

1 Установление ферментной системы, являющейся объектом воздействия ТХ в организме.

2 Умение выделять этот объект из организма.

3 Знание механизма взаимодействия фермента с ТХ и с субстратами в организме.

4 Нахождение аналитической реакции, позволяющей в наглядной форме установить активность фермента.

В таблице 1.3 приведены некоторые данные по ингибированию ферментных систем наиболее токсичными веществами и ядами.

Таблица 1.3 – Данные по ингибированию ферментных систем

токсичными химикатами

 

ТХ	LCt 50, мг · мин · л^-1	Ингибируе-мый фермент	[ С тх], вызывающее ингибирование, мг/л	Роль фермента в жизне-деятельности организма	Возмож- ность использования для индикации
XR	0,00001	Холинаце- тилаза	?	Передача нервного раздражения	-
GB	0,005	Холинэс- тераза	10^-10	То же	+
AC	0,1	Цитохромоксидаза каталаза	10^-8 5 · 10^-6	Внутриклеточное дыхание (процессы энергообмена)	+
CK	0,35	То же	?	То же	-
D	0,025	Гексокиназа	10^-3	Окислитель-ное фосфо-рилирование (процессы энергообмена)	-
L	0,025	Пируватоксидаза	?	Процессы энергообмена	-
CG	0,6	Фактор проницаемости	?	Процессы обмена через клеточные мембраны	-

 

Как свидетельствуют данные, приведенные в таблице 1.3, наиболее токсичные вещества воздействуют на ферменты нервной ткани и процессов энергообмена, причем для целей индикации могут быть использованы только некоторые из этих ферментов.

Практическое применение в индикации в настоящее время нашел только биохимический метод индикации ФТХ, основанный на ингибировании этими ТХ холинэстеразы, поскольку для холинэстеразы изучены и строение активного центра, и механизм действия, и имеются удобные с аналитической точки зрения субстраты (таблица 1.4).

 

Таблица 1.4 – Выполнение условий применения ферментов в индикации

 

ТХ	м ^.мин/л	Объект воздействия	Возможность выделения	Знание механизма	Нахождение аналитической реакции
ХR	1 × 10^-5	Холинацетилаза	-	-	-
VХ	3 × 10^-4		+	+	+
GD	4 × 10^-4	Холинэстераза
GB	2,5 × 10^-3
BZ	1 × 10^-2	Моноаминооксидаза	-	-	-
HD	2,5 × 10^-2	Гексокиназа	+	+	-
АС	1 × 10^-1	Цитохром-оксидаза	+	+	+

 

Сущность биохимического метода индикации состоит в измерении изменения активности фермента после воздействия на него ингибитора (ТХ) и сводится к сопоставлению скоростей каталитического расщепления субстрата ферментом при отсутствии анализируемого вещества (ингибитора фермента) и в присутствии последнего. Естественным субстратом для холинэстеразы является ацетилхолин.

В настоящее время биохимический метод индикации токсичных фосфорорганических соединений используется в различных модификациях. В большинстве методик холинэстеразу инкубируют с ингибитором, затем добавляют стандартное количество ацетилхолина и по количеству выделившейся в результате ферментативного гидролиза уксусной кислоты оценивают количество активного фермента. Количество выделившейся уксусной кислоты может быть определено манометрическим, кондуктометрическим, электрометрическим или колориметрическим методами.

Нашедший наибольшее применение в индикации колориметрический метод основан на использовании рН-индикаторов, например, бромтимолового синего или фенолового красного. Поскольку ферментативный гидролиз специфичного субстрата проходит в слабо забуференной среде, это несколько ухудшает чувствительность определения, так как неизбежен расход уксусной кислоты на преодоление буферной емкости. Последнее обстоятельство привело к попыткам замены ацетилхолина тиохолиновыми эфирами и хромогенными или флуорогенными субстратами, что дает возможность отказаться от рН-индикаторов и использовать в качестве реакционной среды растворы с большой буферной емкостью.

Хотя некоторые из предложенных субстратов (в частности, N-метил-индоксилацетат) расщепляются холинэстеразой с очень высокими скоростями, они обладают рядом недостатков, а именно быстрым спонтанным гидролизом, меньшей избирательностью и т.п., не позволяющих отказаться от использования холиновых эфиров.

В связи с высокой чувствительностью биохимический метод нашел широкое применение для индикации токсичных веществ нервно-паралитического действия. Так, на использовании рН-модификации биохимического метода (бутирилхолин + рН-индикатор) разработана индикаторная трубка на ФТХ. Определение ФТХ основано на их способности ингибировать фермент холинэстеразу (ХЭ), катализирующий гидролиз бутирилхолиниодида (I) в слабощелочной среде до масляной кислоты (II) и холинового спирта (III). Выделяющаяся кислота изменяет рН среды, в результате чего наблюдается переход окраски рН-индикатора фенолового красного, входящего в состав индикаторной рецептуры.

 

Определение ФТХ, основанное на использовании рН-индикатора, имеет существенный недостаток из-за возможного присутствия веществ кислого характера в анализируемом воздухе и их влиянии на переход окраски рН-индикатора фенолового красного.

Для устранения этого недостатка в качестве субстрата применен бутирилтиохолиниодид, а в качестве индикатора – кислотный зеленый, который при взаимодействии с выделяющимся тиохолином образует бесцветное соединение. Тем самым недостаток рН-методики, описанной выше, устраняется. Определение ФТХ основано на их способности ингибировать фермент ХЭ, катализирующий гидролиз бутирилтиохолиниодида (БТХИ) (I) в слабощелочной среде до тиохолинового спирта (III) и масляной кислоты (II).

Изменение цвета индикатора удобно использовать при фотометриро-вании в газосигнализаторах.

В газоопределителях армии США имеется специальное средство (так называемые «билеты») для определения ФТХ биохимическим методом с помощью хромогенных субстратов. С использованием электрохимического варианта ферментативной реакции в США был предложен автоматический сигнализатор для определения ингибиторов холинэстеразы. Определение активности холинэстеразы основано на деполяризации платинового анода тиохолином, образующимся при ферментативной гидролизе тиохолинового эфира холинэстеразой в буферном растворе.

 

Химический метод

В основе химического метода индикации лежат реакции ТХ с различными веществами, приводящие к таким превращениям, которые легко и быстро могут быть зафиксированными тем или иным способом. При этом набольшее применение в индикации находят реакции, приводящие к образованию соединений, отличающихся от исходных по тем свойствам, изменение которых легче всего зафиксировать наиболее простыми способами. Это в первую очередь оптические свойства, окислительно-восстановительная способность, растворимость.

На регистрации изменений оптических свойств реакционной среды при образовании новых соединений основано применение в индикации колориметрических реакций, т.е. реакций, сопровождающихся образованием или разрушением окрашенных продуктов.

Характер окраски соединения или его раствора определяется тем, что оно избирательно поглощает свет с различными длинами волн. В результате процент пропускания потока света через раствор такого вещества оказывается различным при различных длинах волн, что проявляется в виде характерной кривой светопропускания (или кривой поглощения).

Цвет раствора (вещества) определяется, главным образом, длиной волны, соответствующей максимуму поглощения (минимуму пропускания), а также полушириной, т.е. участком кривой, ограниченным расстоянием между длинами волн, равными половинному значению ординаты.

Максимум на кривой поглощения соответствует энергетическому состоянию внешних электронных оболочек молекулы вещества - энергии возбуждения внешних электронных уровней. А поскольку эта энергия является характеристикой, определяемой структурой соединений, то последняя полностью определяет и их окраску.

Однако в практике иногда имеют место некоторые отклонения от общего правила, которые связаны с тем, что для обеспечения наибольшей чувствительности определения требуется соответствие спектра окрашенного соединения и области максимальной спектральной чувствительности воспринимающего устройства (глаза, фотоэлемента и т.п.). Поскольку максимальная область спектральной чувствительности глаза человека приходится на l = 555 нм, для визуальных колориметрических определений выгоднее использовать реакции, приводящие к образованию красителей, окрашенных в красно-пурпурные тона. Такие реакции использованы, в частности, в индикаторных трубках Российской армии на иприт, хлорциан, синильную кислоту, люизит, хлорацетофенон и ряд др. ТХ.

Не менее важным требованием к реакциям индикации является использование таких реакций, которые осуществляются с наиболее высокими скоростями. Поскольку одним из основных требований к реакциям индикации является быстрота проявления аналитического эффекта, для целей индикации используются реакции с наибольшей энтропией и наименьшей энергией активации. Хотя эти величины характеризуют вполне определенную конкретную реакцию между двумя веществами, знание общих закономерностей позволяет находить для определения того или иного ТХ оптимальные реактивы среди однотипных соединений.

Для индикации важно обеспечить не только наиболее быстрое взаимодействие двух веществ, но и наиболее полное их превращение в продукты реакции. Поскольку всякая система стремится к наиболее устойчивому состоянию, полнота образования продуктов реакции определяется их более высокой устойчивостью по сравнению с исходными веществами. Обеспечение этих условий в индикации обеспечивается рядом приемов, наиболее распространенным из которых является выведение одного из продуктов из сферы реакции: либо путем связывания в малодиссоциированное соединение, либо путем экстракции в растворитель, в котором не растворяются исходные вещества и т.п.