Методы обнаружения возбудителей гнильцовых болезней в мёде

Для исследований необходимы люминесцентный микро­скоп МЛ-2 с набором прилагаемых к нему фильтров или обычный биологический микроскоп (МБИ-1, МБИ-3, мБИ-4), оборудованный специальным люминесцентным устройством; осветитель для возбуждения люминесценции препарата (ис­точником света служит ртутная лампа СВД-250); светофиль­тры СС-4, СС-8, опак-иллюминатор ОИ-17 или ОИ-18, пред­метные и покровные обезжиренные стекла, флуоресцирую­щие антиларвейные и антиальвейные сыворотки и контрольная кроличья люминесцирующая сыворотка, спирт этиловый и метиловый, забуференный физиологический раствор (фос­фатный буфер); забуференный глицериновый раствор, не­флуоресцирующее иммерсионное масло, иммерсионные жид­кости, при отсутствии их можно использовать диметилфталат.

Глицериновый буфер готовят смешиванием девяти час­тей нейтрального глицерина и одной части фосфатного буфе­ра с рН 8,0.

Препарат фиксируют этиловым или метиловым спиртом, промывают фосфатным буфером с рН 7,4. Последний готовят путем смешивания 30 мл Г/15 М раствора однозамещенного фосфорнокислого натрия или калия, 120 мл 1/15 М раствора двузамещенного фосфорнокислого натрия и 8,78 г хлористо­го натрия в 1 л дистиллированной воды. Жидкий мёд предварительно тщательно перемешивают и берут пробу. Пробы из засахаренного мёда отбирают щупом с разной глубины; от сотового мёда берут пробу весом 30 г и, удаляя забрус, погружают в 15—20 мл стерильного физио­логического раствора для полного растворения мёда в ячей­ках сотов.

Навеску мёда 15—20 г помещают в стерильную колбочку и добавляют 25—30 мл стерильного физиологического раст­вора (температура 35—40*С). Растворенный мёд центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жид­кость осторожно сливают, к центрифугату опять добавляют 25—30 мл стерильного физиологического раствора, взбалты­вают и еще раз центрифугируют. Из полученного центрифугата параллельно делают два мазка, один из которых окра­шивают по Граму, другой на споры—2%-ным раствором кар­болового фуксина. Для обнаружения Вас. larvae центрифугат высевают на мясо-пептонный сывороточный агар (среда Томашеца) и для Вас. alvei, streptoe, apis—на МПА и МПБ. Выросшую культуру возбудителя идентифицируют согласно общепринятым бактериологическим методам.

В тех случаях, когда из-за низкой плотности инфицирования мёда бактериологическим методом выделить возбудите­лей нельзя, можно применять метод флуоресцирующих анти­тел с использованием антиларвейной и антиальвейной сыво­роток.

Для этой цели используют следующую методику: 15—20 г мёда растворяют в 25—-30 мл физиологического раствора и центрифугируют. Из центрифугатов делают мазки, фиксиру­ют этиловым спиртом в течение 15 мин, высушивают на воз­духе, затем увлажняют фосфатным буфером с рН 7,4 и опять высушивают. Препараты окрашивают прямым способом. Для этого на мазок наносят каплю соответствующей флуоресци­рующей сыворотки, помещают в чашку Петри с влажным тампоном ваты и выдерживают при Температуре 37°С в то­чение 35—45 мин. Окрашенные мазки промывают тем же буферным раствором, дважды сменяя раствор через 20 мин, и ополаскивают дистиллированной водой. На высушенные мазки помещают каплю буферного глицерина, покрывают тонким покровным стеклом, на которое наносят нефлуорес­цирующее иммерсионное масло и просматривают под люми­несцентным микроскопом МЛ-2 по общепринятой методике.

Сыворотки по заявке поставляет Украинский научно-ис­следовательский институт экспериментальной ветеринарии.

Степень свечения микробных клеток оценивают по четы­рехбалльной системе:

+ + + +—сияющее золостисто-зеленоватое свечение палочек и спор Вас. larvae с ярко выраженными контурами микробных клеток;

+++—яркое зеленоватое свечение палочек и спор с чет­ко выраженными контурами;

+ +—умеренное зеленовато-желтоватое свечение клеток

и спор с отчетливыми контурами;

+—слабое сероватое свечение микробных клеток испор с неясными контурами;

- - клетки незаметны или в виде серых теней. Оценивают степень свечения большинства клеток. В конт­роле с чистой культурой Вас. larvae, окрашенной флуоресци­рующей антиларвейной сывороткой, свечение должно быть (+ + + +); при окраске препаратов, приготовленных из цент, рифугатов мёда антиальвейной флуоресцирующей сыворот­кой, свечение должно быть (+ +) и (+).

Мёд, инфицированный возбудителями гнильцовых болез­ней пчел, после автоклавирования при температуре 120°С в течение 20 мин может быть использован для кормления пчел или его направляют в кондитерскую промышленность.

 

Вопросы для самопроверки

1. Классификация мёда.

2. Материалы, используемые для фальсификации мёда.

3. Характеристики искусственного мёда.

4. Основные показатели натурального мёда (влага, кис­лотность, диастаза, примеси и др.).

5. Характеристика подогретого и незрелого мёда.

6. Особенности осадка при кристаллизации мёда.

7. Ветсанэкспертиза мёда.

8. Органолептические методы исследования мёда.

9. Лабораторные методы исследования мёда при подозре­нии на фальсификацию.

10. Ветсаноценка мёда.

ЛИТЕРАТУРА

1. Колоболотский Г. В. Справочник по ветеринарно-санитарной экс­пертизе продуктов на мясо-молочных и пищевых контрольных станциях.— М.: Колос, 1974.—239 с.

2. Правила ветеринарно-санитарной экспертизы меда на мясо-молочных и пищевых контрольных станциях и в ветеринарных лабораториях ГУВМСХ СССР.—М.: Колос, 1979.—12 с.

3. Пчеловодство. Термины и определения. ГОСТ,25629-83.

4. Житенко П. В., Боровков М. В., Макаров В. А. Справочник по ветеринарно-санитарной экспертизе продуктов животноводства.—М.: Колос, 1980.—189 с.

б. Ряховский В. И. Мед, воск, прополис.—Алма-Ата: Кайнар, 1983.— 83 с.

6. Чернигов В. Д. Мед.—Минск: Урожай, 1979.—78 с.

7. Чудаков В. Г Технология продуктов пчеловодства.—М.: Колос, 1979.—49 с.

8. Касаткин В. С. Ветеринарно-санитарная экспертиза меда ГСХИ, Горький, 1985.—29 с.