Еритроцити, підрахунок кількості еритроцитів, гемоглобіну та отримання кристалів геміну Лейкоцити та швидкість осідання еритроцитів

Мета роботи: ознайомитися з методами підрахунку еритроцитів, та лейкоцитів, визначення гемоглобіну, вміст їх у крові; отримати кристали геміну, навчитися визначати ШОЕ; ознайомитися з методикою фарбування мазка крові по Романовському.

Основні положення

Підрахунок еритроцитів і лейкоцитів крові можна проводити візуально, користуючись мікроскопом і спеціальною лічильною камерою, а також за допомогою електроеритрогемометра або фотоелектроколориметра. Існують також автоматичні електронні лічильники, які дають змогу виконувати одночасно дослідження численних проб крові.

Лічильна камера (рис.1) складається з товстого прямокутного (предметного) скла, в центральній частині якого нанесено (вигравірувано) дві сітки Горяєва, розмежовані глибокою поперечною канавкою. Збоку від сіток розташовані скляні прямокутні пластинки, до яких притирається шліфоване накривне скельце (рис. 1а). Сітка Горяєва (рис. 1б) складається з 225 великих квадратів (15Х15). Частину з них розділено вертикально і горизонтально на 16 малих квадратів, які чергуються з квадратами, що поділені тільки вертикальними або горизонтальними лініями, і з чистими квадратами, без ліній. Глибина камери дорівнює 1/10мм, бік малого квадрата – 1/20мм, отже, об’єм малого квадрата становить 1/4000мм³ (1/20Х1/20Х1/10=1/4000). Це важливо пам’ятати для правильного розрахунку числа еритроцитів чи інших формених елементів.

Перед тим, як заповнити камеру, її миють і висушують, так само як і накривне скельце. Накривне скельце притирають до камери так, щоб з’явилися райдужні кільця (ньютонові). Лише за цих умов витримуватимуться необхідна висота і правильний об’єм камери. Щоб ознайомитися з сіткою Горяєва необхідно помістити її під мікроскоп і роздивитися з першу під малим, потім під великим збільшенням.

При підрахунку формених елементів кров спочатку розводять, щоб зменшити число клітин, які підраховують. Для підрахунку еритроцитів кров розводять у 200 разів, лейкоцити – у 20 разів. Для розведення крові можна скористатися змішувачами-меланжерами (рис. 1б). Змішувач-меланжер являє собою піпетку з ампулоподібним розширенням, в якому знаходиться бусинка (у змішувачі для еритроцитів – червона, для лейкоцитів – біла). Бусинка сприяє кращому перемішуванню крові з рідиною, якою її розводять. На капілярі змішувача нанесено дві позначки: 0,5 і 1,0. Третя позначка знаходиться за ампулоподібним розширенням, на змішувачі еритроцитів позначка 101, для лейкоцитів – 11. На короткий кінець змішувача натягують гумову трубку, кінець якої беруть ротом або грушею і насмоктують у капіляр кров і розріджувач.

Для підрахунку формених елементів доцільно застосовувати зручний і досить точний метод розведення крові у пробірках – пробірковий метод. При цьому рідини для розведення крові точно відмірюють піпеткою в пробірки, туди ж вносять виміряну кількість крові (20мкл).

Для розведення крові, при підрахунку еритроцитів застосовують гіпертонічний (3%-й) розчин хлориду натрію, в якому еритроцити зморщуються.

Рис.1. Лічильна камера вигляд зверху;

а) сітка Горяєва (1- малий квадрат, б); змішувач для еритроцитів (в); змішувач для лейкоцитів (г).

(1 – малий квадрат, 2 – великий квадрат, б); змішувач для еритроцитів (в); змішувач для лейкоцитів (г).

Визначення гемоглобіну гемометром ГС-3 (Салі) ґрунтується в колориметрії солянокислого гематину, що утворюється при змішуванні крові з соляною кислотою. При цьому червонуватий колір рідини стає бурим. Розчин розводять водою до кольору стандарту з відомою концентрацією гемоглобіну.

Гемометр ГС-3 (рис 2)складається з пластмасового корпусу з трьома гніздами, задню стінку зроблено з матового скла. У два крайні гнізда вставлено запаяні пробірки, які містять кольоровий розчин солянокислого гематину. Середня відкрита градуйована пробірка призначена для досліджуваної крові. На ній нанесено дві шкали: одна показує концентрацію гемоглобіну в г% (градуювання від 2 г%), друга у відносних одиницях (градуювання до 140). 16,7 г% гемоглобіну прийнято за 100 одиниць, тобто 1 г гемоглобіну відповідає 6 одиницям. На всі три пробірки гемометра нанесено контрольні кругові позначки, які при аналізі мають бути на одному рівні. До приладу додано капіляр-піпетку з позначкою на 20 мкл (0,02 мл) крові, скляні палички та очну піпетку.

Рис. 2. Гемометр ГС-3:1- корпус, 2- запаяні пробірки із стандартом, 3- градуйована пробірка, 4- піпетка (капіляр) для взяття крові.

 

При підрахунку лейкоцитів кров розводять 3%-м розчином оцтової кислоти, підфарбованим метиленовим синім або генціанвіолетом. Кислота руйнує оболонку еритроцитів, вони стають невидимими і не заважають підрахунку лейкоцитів Підфарбовані ядра лейкоцитів легше помітити.

Швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ) залежить від з’єднання еритроцитів, внаслідок чого вони осідають на дно посудини. Еритроцити заряджені негативно, і тому вони відштовхуються один від одного. Але при адсорбції різного роду часточок (наприклад, білку) еритроцити втрачають свій заряд, що дає можливим їх з’єднання з іншими еритроцитами. Грудочки еритроцитів, що утворилися, починають осідатися на дно посудини, куди було поміщено кров. У здорової людини адсорбція незначна і відповідно швидкість зсідання еритроцитів дуже мала: за 1 год. вони зсідають на 7-12 мм у жінок і на 3-7 мм у чоловіків. При патологічних станах (наприклад, при запальних процесах), а також при вагітності ШЗЕ може різко збільшуватися.

Для визначення ШОЕ служить прилад, що складається із штатива, який має гнізда для капілярів. Кожне гніздо вислано еластичною гумкою. Капіляр прокалібрований: на ньому нанесені поділки від 0 до 100 мм. На поділці 50 мм є мітка Р (розчин), а на поділці 0 - К (кров).

Гемоглобін крові в присутності льодяної оцтової кислоти і хлориду натрію переходить в сполуку, яка називається геміном. В геміні залізо трьохвалентне і пов’язане з хлором. Гемін має характерну форму кристалів, що дозволяє користуватись цією реакцією в практиці судової медицини для виявлення плям крові. Практично для отримання кристалів геміна добавляється тільки льодяна оцтова кислота, бо іони Nа⁺ та СІ^- завжди є в плазмі крові.

Матеріали та обладнання: мікроскоп, лічильна камера Горєва, пробірки (краще центрифужні), піпетки, 3%-й розчин хлориду натрію, 3%-й розчин оцтової кислоти, підфарбований метиленовим синім або генціанвіолетом, стерильний скарифікатор, спирт, ефір, гемометр ГС-3, вата, дистильована вода, 0,1 н. розчин соляної кислоти, цитратна кров людини, предметні та покрівні скельця, льодяна оцтова кислота, спиртівка, прилад для визначення ШОЕ., годинникове скло, 5%-ний розчин цитрату або оксалату натрію, метиловий спирт, фарба Романовського;

 

ХІД РОБОТИ

Дослід № 1. Підрахунок еритроцитів.

У чисту суху пробірку відмірюють піпеткою 4мл 3%-го розчину хлориду натрію. Скарифікатором проколюють крайову вену вуха кроля, додержуючи правила септики та антисептики. В мікропіпетку набирають 20мкл крові (до позначки на піпетці) і вносять її у розчин в пробірці, кілька разів промивають піпетку (втягуючи розчин у піпетку і видуваючи його у пробірку). Перемішують рідину у пробірці, постукуючи пальцем по її дну, щоб еритроцити розподілилися в рідині рівномірно. Кров розведена у 200 разів.

Потім заповняють камеру суспензією еритроцитів. Для цього піпеткою або скляною паличкою наносять каплю розведеної крові на середню пластинку біля краю накривного скельця. Після заповнення камери вичікують 1-2 хв. (доки осядуть формені елементи) і починають підрахунок при малому збільшенні мікроскопа в затемненому полі зору (з прикритою діафрагмою і трохи опущеним конденсором мікроскопа. Рахують еритроцити у 5 великих або 80 малих квадратах (5Х16=80 малих квадратів), розташованих по діагоналі, оскільки розподіл кліток у камері може бути нерівномірним. Для цього під мікроскопом відшукують верхній великий квадрат (поділений на 16 малих), підраховують кількість еритроцитів у ньому, потім посувають камеру по діагоналі вниз і направо, до наступного квадрата і т.д.

Підлягають підрахунку всі еритроцити в межах маленького квадрата, а також ті, що знаходяться на лівій і верхній лініях його або дотикаються до них з обох боків. Еритроцити на правій і нижній лініях і ті, що дотикаються до них, не враховуються – це зроблено в наступному квадраті.

Кількість еритроцитів у 1 мкл крові розраховуються за формулою:

 

Е=

Де Е – кількість еритроцитів в 1 мкл крові; А – кількість еритроцитів, виявлених у певній кількості малих квадратів; Б – кількість малих квадратів, у яких пораховано еритроцити; В – ступінь розведення крові; 4000 – множник для підрахунку кількості еритроцитів на 1 мкл. Об’єм малого квадрата дорівнює 1/4000 мм³або 1/4000 мкл. Помноживши його на 4000, зводимо до об’єму 1 мм³ або 1мкл крові.

Дослід № 2. Визначення гемоглобіну гемометром ГС-3 (Салі).

У гранульовану пробірку гемометра очною піпеткою наливають 0,1 н. розчин соляної кислоти до позначки „ - ”. Потім беруть кров Ії судини в капіляр до позначки (20 мкл), обтирають кінчик капіляра ватою, занурюють його у пробірку з кислотою і видувають кров на дно пробірки так, щоб верхній шар соляної кислоти лишився непофарбованим. Не виймаючи піпетку, промивають її розчином соляної кислоти з верхнього шару, а потім дистильованою водою, видуваючи її у пробірку. Після цього вміст пробірки перемішують, постукуючи пальцем по дну, ставлять пробірку в середнє гніздо гемометра на 5-10 хв. Це час, необхідний для повного перетворення гемоглобіну на солянокислий гематин. Потім у пробірку по краплині додають очною піпеткою дистильовану воду доти, поки колір розчину не стане однаковим із стандартом. Додаючи воду розчин перемішують скляною паличкою. Проводять відлік по градуйованій шкалі пробірки. Цифра на рівні нижнього менікса одержаного розчину вказує вміс гемоглобіну в досліджуваний крові по одній шкалі у грам-процентах (г%), тобто абсолютний вміст гемоглобіну в крові. Друга шкала вказує вміст гемоглобіну у відносних одиницях. Зниження концентрації гемоглобіну в крові спостерігається при різних анеміях (через кровотечу, недостаток заліза, цианокобаламіну (віт. В₁₂), фолієвої кислоти, і т.д.).

Підвищення концентрації гемоглобіну в крові трапляється при збільшенні кількості еритроцитів, легенево-серцевій недостатності, пороках серця.

Дослід № 3. Одержання кристалів геміну.

Помістіть краплю крові на край предметного скла і розподіліть її по всій поверхні тонким шаром. Для цього друге предметне скло приставте коротким краєм до краплі крові так, щоб між двома стеклами утворився гострий кут. Зробіть мазок крові, переміщуючи друге скло по поверхні першого. Підсушіть мазок на повітрі (без підігріву!). Зскребіть підсушену кров, залишивши її на тому ж склі, добавте 1-2 краплі льодяної оцтової кислоти, ретельно перемішайте, накрийте покривним склом і дуже повільно, обережно нагрівайте отриману суміш, проносячи скло над вогнем спиртівки. Найдіть кристали, які утворилися, при малому збільшенні, а потім роздивіться їх при великому збільшенні мікроскопа. Замалюйте форму кристалів геміну. Проаналізуйте отримані дані і зробіть висновки.

Дослід № 4. Підрахунок лейкоцитів.

У пробірку вносять 0,4 мл 3%-го розчину оцтової кислоти, підфарбованої генціанвіолетом, додають (мікропіпеткою) 20 мкл крові і добре перемішують. Одержують розведення крові у 20 разів. Заповнюють камеру, як це робили при підрахунку еритроцитів. Оскільки лейкоцитів менше, ніж еритроцитів, то для точності підрахунку провадять у 100 великих квадратах (які не розграфлені на малі), що відповідає 1600 малим квадратам. Розрахунок роблять за формулою:

 

Л=

Де А – полічена кількість лейкоцитів; Б – кількість малих квадратів, в яких підрахували еритроцити; В – ступінь розведення крові; 4000 – множник для перерахунку кількості лейкоцитів на 1 мкл; Л –кількість лейкоцитів у крові.

Дослід № 5. Визначення швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ).

Капіляр приладу для визначення ШОЕ добре прополоскати 5%-ним розчином цитрату або оксалату натрію, наберіть в нього розчин до мітки Р і видуйте його на годинникове скло. Потім в цей же капіляр наберіть кров до мітки К. Для попадання крові в капіляр кінчик його приставте до краплі крові, а сам капіляр тримайте майже горизонтально, тоді кров надходить в капіляр без натягування її ротом.

Кров, що набрали, видуйте на те саме годинникове скло в розчин цитрату натрію. Суміш, що утворилася на годинниковому склі, ретельно перемішайте, наберіть в піпетку і знову видуйте на годинникове скло. Повторіть це декілька разів, а потім наберіть суміш точно до мітки К. Для набирання суміші тримайте капіляр майже горизонтально, а кінчик його приставте до суміші, що знаходиться на годинниковому склі. Капіляр переведіть у вертикальне положення, попередньо зажавши верхній отвір вказівним пальцем, і поставте у одне з гнізд. Верхній кінець капіляру можна відкривати тільки тоді, коли його нижній кінець щільно придавить гумку гнізда. Позначте час, коли капіляр був поставлений у гніздо приладу. Внаслідок поступового зсідання еритроцитів верхній шар розчину, що знаходиться в піпетці, стає світлим. За висотою не зафарбованого стовпчика визначте, на скільки міліметрів зсілися еритроцити за 1 год. Це і буде величина ШОЕ.

Дослід № 6. Фарбування мазка крові по Романовському.

Висушені на повітрі і підписані мазки фіксуються метиловим спиртом протягом 3 хв, потім розкладають на містку і після висихання фіксатора покривають на 20-25 хв. Розведеною по титру фарбою Романовського. Краску зливають, а мазки змивають водою і висушують.

Зміст звіту

1. Тема роботи.

2. Результати і висновки.

Контрольні питання

1. Чим відрізняється сироватка крові від плазми?

2. Опишіть камеру Горєва.

3. Що таке пробірковий метод розведення крові для підрахунку формених елементів?

4. Опишіть техніку підрахунку еритроцитів.

5. В яких одиницях вимірюють кількість еритроцитів?

6. Яка роль тромбоцитів у життєдіяльності організму?

7. Яке значення лейкоцитарної формули?

8. Принцип колориметричного визначення гемоглобіну.

9. Що таке солянокислий гематин?

10. Які фактори впливають на вміст гемоглобіну в крові?

11. В яких одиницях виражається концентрація гемоглобіну в крові?

Лабораторне заняття № 3