Генетическая трансформация половых клеток животных

Если вводить ДНК в клетки многоклеточного организма, то результатом трансформации будет изменение свойств лишь небольшого числа клеток, которые приобрели новый ген. В этом случае животное будет химерным (т. е. клетки разных тканей будут иметь разный генотип).

Следовательно, для изменения свойств всего организма следует изменять геном половых клеток или зиготы, которые передадут новые свойства потомкам. Разработаны способы введения генов в эмбриональные клетки разных животных, в том числе млекопитающих и мух.

Существует две основные схемы создания трансгенных животных: микроинъекция чужеродной ДНК и введение генетической конструкции в эмбриональные стволовые клетки.

Микроинъекция чужеродной ДНК. Первая попытка была сделана американским ученым Дж. Гордоном в 1980 г. Методом микроинъекции он ввел в оплодотворенную яйцеклетку мыши рекомбинантную плазмиду pBR322, которая содержала ген тимидинкиназы вируса герпеса и фрагмент генома вируса SV40, вызывающего опухолевую трансформацию. В дальнейшем в геном мыши и других животных удалось ввести гены интерферонов, гормона роста человека и ряд других.

Микроинъекцию клонированных генов проводят в один или оба пронуклеуса только что оплодотворенной яйцеклетки мыши. Чаще выбирают мужской пронуклеус. После инъекции яйцеклетку немедленно имплантируют в яйцевод приемной (суррогатной) матери или дают ей возможность развиваться в культуре до стадии бластоцисты, после чего имплантируют в матку.

Для отбора трансгенных особей (несущих введенный ген) проводят молекулярно-генетический анализ родившегося потомства. Скрещивая трансгенных животных, можно получить чистые (гомозиготные) трансгенные линии.

Недостатком технологии создания трансгенных животных путем микроинъекции генетических конструкций в пронуклеус яйцеклетки является ее трудоемкость и мало-эффективность: полного развития достигает менее 1-5 % зигот.

Можно вводить ген в сперматозоиды и затем проводить ими оплодотворение. Таким образом были введены гены интерферона и инсулина человека, ген (3-глобина кролика, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса и кДНК вируса лейкемии мышей.

Введение генетической конструкции в эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). Впервые культивируемые линии ЭСК из бластоцист мыши были получены Эвансом, Кауфманом и Мартином в 1981 г. Позже аналогичные линии были получены из бластоцист других млекопитающих: золотистый хомячок (1988); свинья, овца (1990); корова, норка (1992); кролик (1993); крыса (1994); обезьяна (1995) и даже человек (1994).

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обычно получают из бластоцист. Когда число клеток (бластомер) эмбриона не превышает восьми, они являются недифференцированными, плюрипотентными (тотипотентными), т. е. способны дифференцироваться в любые типы клеток, включая клетки зародышевой линии, и каждая из них может дать начало новому организму. Эти клетки можно культивировать in vitro и после введения в них необходимого трансгена ввести в другой эмбрион на стадии бластоцисты, а затем имплантировать в матку суррогатной матери, производящей потомство. Скрещивая животных-основателей, несущих трансген в клетках зародышевой линии, можно получить линии трансгенных животных.

В отличие от предыдущего, этот метод позволяет проанализировать встраивание трансгена в геном клетки на стадии бластоцисты и проверить его экспрессию, что дает возможность выбрать линию ЭСК с наилучшими свойствами. Часть этих клеток можно заморозить в жидком азоте и хранить многие годы для последующего создания трансгенных животных.

Такой путь получения трансгенных животных выгоден еще и тем, что используются не зиготы, а бластоцисты. Их легко получить нехирургическим путем из половых путей самок крупных видов млекопитающих и трансплантировать суррогатным матерям для рождения трансгенных животных — основателей трансгенных линий.

Создание трансгенных животных — очень сложный и трудоемкий процесс. По статистике одно трансгенное животное удается получить на 40 инъецированных зигот мыши, на 100 зигот овцы или козы, на 1500 зигот коровы. К тому же это и неоднозначный процесс. Так как интеграция чужеродных генов носит случайный характер, могут быть повреждены соседние гены реципиента. Из трансгенных животных не более 50 % экспрессируют трансгенный белок, не у всех животных чужой ген попадает в половые клетки, т. е. способен передаваться потомству.

Клонирование животных

Клоном называется популяция клеток или организмов — потомков одной клетки или организма, полученных неполовым путем. Таким образом, все особи в клоне имеют идентичный набор генов и должны быть точной копией взятого для размножения экземпляра (соответствующего прототипа).

У животных можно получить подобные клоны в том случае, когда используемые объекты размножаются путем партеногенеза, т. е. бесполым путем, без предварительного оплодотворения. В России блестящие работы по клонированию выполнены на шелкопряде академиком В.А. Струнниковым. Выведенные им клоны шелкопряда (партеноклоны мужского пола, дающие на 20 % больше шелка, чем женские) известны на весь мир.

Высшие животные в природе размножаются только половым путем. Клетки животных, дифференцируясь, лишаются тотипотентности. Поэтому для их клонирования в основном используют недифференцированные делящиеся клетки.

Для клонирования животных ядро оплодотворенной яйцеклетки заменяют ядром, взятым от другой особи (с другой генетической информацией). Оказалось, что тотипо-тентность (возможность развиваться во взрослую особь) сохраняют ядра из клеток очень ранних эмбрионов. Это позволяет проводить искусственное разделение четырех — восьми клеточных эмбрионов на отдельные клетки, культивировать их in vitro до стадии бластоцисты и имплантировать в матку суррогатной матери, где они развиваются до рождения. Таким путем можно получать генотипически одинаковые особи (однояйцевых близнецов).

Сенсационность работы доктора Я. Вильмута и соавторов из Шотландии (1997) заключается в том, что впервые для клонирования млекопитающих были использованы ядра соматических (дифференцированных) клеток взрослой овцы (клетки соединительной ткани — фибробласты) бело-мордой породы Финский дорсет, выделенные из вымени овцы.

Клонирорание овцы осуществлялось методом переноса ядра. Ядро яйцеклетки удаляли с помощью микропипетки. Затем культивировали эпителиальные клетки молочной железы взрослой особи, индуцировали их переход в фазу G_o и провели слияние клеток в G_o фазе и яйцеклеток, лишенных ядра овец шотландской черномордой породы. Выращивание восстановленных яйцеклеток осуществлялось в культуре или в яйцеводе до ранних стадий эмбриогенеза, а затем их имплантировали в матку суррогатной матери черномордых овец, где и происходило дальнейшее развитие. В результате появилась всемирно известная овца Долли, генотип и фенотип (беломордый ягненок) которой были полностью идентичны исходной матери. В эксперименте было проведено слияние 277 яйцеклеток с удаленными ядрами с клетками молочной железы в G_o фазе; из 29 эмбрионов только один развился до жизнеспособного плода.

Перенос ядра соматической клетки в энуклеированную зиготу (безъядерную) успешно проведен на мышах японскими учеными. Имеются сообщения о клонировании свиньи, коровы, кошки. Таким образом, была доказана способность ядер соматических клеток обеспечивать нормальное развитие млекопитающих.

Исследования по клонированию животных имеют фундаментальное значение. Полная схожесть организмов дает возможность сравнивать влияние на них различных препаратов и внешних условий (например, оценивать мутагенность различных химических соединений); выяснить механизмы дифференцировки клеток в процессе онтогенеза и возможность управления этими процессами. Это открывает путь к генотерапии и искусственному созданию органов для трансплантации. Появление клонов важно и для испытания новых лекарств.