Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК

Секвенирование позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность ДНК длиной 100-500 нуклеотидных пар. Это необходимо для выяснения структуры, функций, возможностей рекомбинации и амплификации молекул или фрагментов молекул нуклеиновых кислот.

С помощью ферментов ДНК разделяют на фрагменты и определяют в них позиции нуклеотидов химическим или энзиматическим методом.

Химический метод был предложен в 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом. Он основан на химической деградации ДНК — специфической химической модификации пуриновых и пиримидиновых оснований с последующими выщеплением модифицированных нуклеотидов из цепи ДНК и анализом образовавшихся продуктов методом гель-электрофореза. Перед началом опыта один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изотопа фосфора ³²Р. Полученные электро-фореграммы проявляют с помощью рентгеновской пленки. Таким образом, фракционируя на одной гелевой пластине фрагменты, образовавшиеся после специфического выщепления каждого из четырех нуклеотидов (А, Т, Г и Ц), можно непосредственно читать нуклеотидную последовательность секвенируемой ДНК по проявленной электрофореграмме.

Энзиматический метод, разработанный М. Сэнгером, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Сэнгер использовал ДНК-полимеразу I. Анализируемый фрагмент ДНК используют в качестве матрицы в реакции полимеразного копирования (синтеза комплементарной цепи ДНК) с помощью ДНК-полимеразы I E. coli. Метод получил название «плюс-минус-метод», поскольку реакцию полимеризации в нем изначально проводили либо в отсутствие одного из четырех типов нуклеотидов («минус»-система), либо в присутствии только одного нуклеотида («плюс»-система), что ограничивает возможность наращивания полинуклеотидной цепи, т. е. останавливает (терминирует) ее синтез из-за недостатка соответствующего нуклеотида. Затем для остановки синтеза стали использовать специальные молекулы — терминаторы. Продукты реакций анализируют методом электрофореза, и секвенируемую последовательность считывают с радиоавтографа, так же как при анализе химического секвенирования.

В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого фрагмента ДНК вполне разрешимая задача. Уже определены последовательности не только сотен генов про- и эукариот, но и геномы многих организмов (более 800). Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка.

Конструирование фрагментов рекомбинантных ДНК («сшивка»)

Фрагменты рекомбинантных ДНК, полученные после действия рестриктаз и содержащие определенные гены, «сшивают» одним из трех основных методов, в зависимости от того, какие концы имеют фрагменты «сшиваемых» ДНК — «тупые» или «липкие».

«Сшивка» по одноименным «липким» концам. Это наиболее простой и популярный метод. Впервые этим методом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 г. Любые два фрагмента ДНК (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, дающей фрагменты рестрикции с «липкими» концами, могут «слипаться» за счет образования водородных связей между однонитиевыми участками комплементарных нуклеотидов. Однако после такого спаривания полная целостность двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, т. е. «сшивания», или лигирования, нитей, используют ДНК-лигазу бактериофага Т4. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию: «сшивание» фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.

«Сшивка» по «тупым» концам. «Тупые» концы можно соединять за счет действия ДНК-лигазы. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при «сшивке» по «липким» концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 г. П. Бергом в Стэнфордском университете (США). В частности, этот метод, используют при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах. «Сшивка» фрагментов с разноименными концами. В ситуации, когда необходимо «сшить» фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции и имеющие разные, т. е. некомплементарные друг другу, «липкие» концы, применяют так называемые линкеры (или «переходники»). Линкеры — это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Г. Шеллер с сотрудниками в 1977 г. Существуют большие наборы таких генных «переходников». «Липкие» концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с «тупыми» концами. При этом первоначально «достраивают» недостающие фрагменты, чтобы образовались комплементарные «липкие» концы. Далее для ковалентного соединения двух фрагментов используют ДНК-лигазу. Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимно-комплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью.

Гибридизация — метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов

Реакция гибридизации используется в генетической инженерии для анализа гибридных молекул ДНК как весьма чувствительный метод выявления определенных последовательностей в ДНК и РНК.

Гибридизация основана на способности азотистых оснований образовывать комплементарные пары. Если солевой раствор ДНК нагреть до 100 °С и повысить рН до 13, то ДНК диссоциирует на две отдельные цепи (денатурирует, плавится), так как комплементарные связи между основаниями разрушаются. Этот процесс (его называют ренатурацией или гибридизацией, отжигом) обратим: выдерживание ДНК при температуре 65 °С приводит к восстановлению структуры двойной спирали. Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК — ДНК, РНК — РНК, РНК — ДНК.

Для теста необходимо иметь одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, которую хотим обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК-зондом. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов.

 

Методы клонирования ДНК

Методами клонирования фрагменты ДНК любого вида, полученные с помощью рестриктаз, можно ввести в плазмиду или в бактериофаг, получив таким образом вектор, а затем размножить эти генетические элементы в клетках бактерий или дрожжей, увеличивая их число в миллионы раз. Методы клонирования ДНК основаны на двух подходах:

— использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК (клонирование ДНК in vivo), а также создание банка генов (геномной библиотеки);

— амплификация ДНК in vitro.

Для биотехнологических экспериментов часто необходимо идентифицировать гены, кодирующие определенные структурные белки. Искомые последовательности можно обнаружить и идентифицировать благодаря геномным библиотекам, используя три широко распространенных метода: гибридизацию с меченым ДНК-зондом (ДНК-гибридизация) с последующим радиоавтографическим анализом, иммунологический скрининг, скрининг по активности белка, кодируемого искомым геном.

ДНК-гибридизация состоит в комплементарном спаривании ДНК-мишени и меченого ДНК-зонда. Гибридные молекулы наиболее часто определяют радиоавтографическим методом.

Два других метода предполагают обнаружение ДНК-мишени благодаря продукту ее экспрессии — белку или его части. Присутствие белка обнаруживают иммунологическими методами (иммунологический скрининг) либо по активности белкового продукта, если таковая имеется (скрининг по активности белка).

Получение нужного гена, намеченного для переноса, возможно либо путем выделения его из подходящего генома, либо методами синтеза химическим или ферментативным путем, либо с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Часто нужный ген выделяют из банка генов.

Клонирование ДНК in vivo

Чтобы клонировать ДНК in vivo, создают банк генов (библиотеку ДНК), т. е. коллекцию клонов ДНК, включающих все фрагменты генома данного вида. Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК).

Геномная библиотека. Первую геномную библиотеку создал Т. Маниатис с сотрудниками в 1978 г. Они использовали ДНК из генома D. melanogaster, которую клонировали в клетках Е. coli. Для создания банка генов выделяют всю геномную ДНК, разрезают ее с помощью рестриктаз или методом «дробовика» (ультразвуком) на отдельные фрагменты, присоединяют к плазмидным или вирусным векторам и вводят в реципиентные бактерии для их последующего клонирования.

Многие плазмиды-векторы несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то трансформированные клетки (колонии) легко выявлять, выращивая их на среде с антибиотиком. Каждая такая колония представляет собой клон, или потомство, одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид, несущих разные участки генома, можно назвать библиотекой геномной ДНК. В таком виде банк можно сохранить.

Недостаток геномных библиотек в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержит полноразмерные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интрон-ные последовательности.

Библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго. В ней содержится вся наследственная информация организма. Банк генов — это не только источник для получения нужного трансгена, но и источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функций белков. С его помощью можно также решить проблему сохранения генофонда исчезающих видов.

Поиск нужных генов в геномной библиотеке. Одним из методов поиска нужных генов в банке является гибридизация, включающая блоттинг (от англ. blotting — промокание). Блоттинг — это метод перенесения фрагментов нуклеиновых кислот на специальную пленку (мембрану) из нитроцеллюлозы, связывающую (иммобилизующую) эти молекулы.

Саузерн-блоттинг (назван по фамилии предложившего его автора) основан на перемещении фрагментов ДНК благодаря капиллярному эффекту. Процесс переноса фрагментов ДНК, находящихся в агарозном геле, на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги похож на промокание.

Анализ проводят в такой последовательности:

— выделенную ДНК разделяют в агарозном геле, где происходит электрофоретическое разделение ее фрагментов по массе и заряду;

— после разделения фрагментов ДНК в агарозном геле его обрабатывают растворами, денатурирующими ДНК (происходит образование одноцепочечных ДНК). Далее гель помещают на фильтровальную бумагу, смоченную концентрированным солевым (буферным) раствором;

— на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр, на который происходит иммобилизация (или адсорбция, или фиксация) одноцепочечных фрагментов ДНК;

— поверх фильтра накладывают стопку листов сухой фильтровальной бумаги, которая обеспечивает медленный ток буферного раствора через гель (т. е. служит своеобразным капиллярным насосом). Солевой раствор, проходя через агарозный гель, увлекает за собой фрагменты ДНК, которые задерживаются нитроцеллюлозой и связываются с ней, а раствор впитывается сухой фильтровальной бумагой;

— фильтр выдерживают в вакууме при температуре 80 °С, в результате чего одноцепочечные фрагменты ДНК необратимо иммобилизуются (фиксируются) на нитроцеллюлозе. При этом расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле;

— ДНК, связанную с фильтром, помещают в раствор с меченым ДНК-зондом, в котором происходит гибридизация. Гибридизироваться (образовывать водородные связи) со специфическим зондом будут только комплементарные ему фрагменты ДНК, которые можно обнаружить в виде темных полос на рентгеновской пленке, т. е. на радиоавтографии нитроцеллюлозного фильтра.

Для анализа РНК применяют Нозерн-блот-гибридизацию, во многом похожую на Саузерн-блоттинг. В данном случае молекулы РНК, выделенные из клетки, разделяются по размерам с помощью гель-электрофореза, а затем переносятся на фильтр. После гибридизации с меченым одноцепочечным зондом выявляются места гибридизации (гомологии) РНК и зонда. В этом методе в качестве зонда обычно используют фрагменты ДНК.

Амплификация ДНК in vitro

Амплификация — это увеличение числа копий молекул ДНК. В отличие от клонирования ДНК in vivo, которое происходит в клетках прокариот, дрожжей, других эукариотических организмов, амплификация осуществляется вне клетки (in vitro) с помощью химических методов: полимеразной цепной реакции (ПЦР), лигазной цепной реакции, NASBA-метода (Nucleic Acid Sequence — Base Amplification).

В 1985 г. К. Мюллис с сотрудниками разработал метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил, название полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификация фрагментов ДНК осуществляется благодаря работе особого фермента Taq-полимеразы (термо-стабильная ДНК-полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus) в присутствии четырех типов нуклеотидов и праймеров (коротких цепочек ДНК размером около 20 нуклеотидов, которые выступают в качестве затравок). Процесс циклический, проходит в несколько этапов: термическая денатурация (разделение комплементарных цепей ДНК при температуре 93-95 °С), охлаждение до 60 °С, связывание праймеров с одноцепочечными ДНК, синтез второй нити ДНК с помощью Taq-полимеразы. Повторяя циклы амплификации, можно получать миллионы копий фрагментов ДНК. Таким образом, в процессе рассматриваемой реакции эффективно амплифицируется только та последовательность ДНК, которая ограничена праймерами.

Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning). Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3-4 ч, что существенно быстрее и проще процедуры клонирования определенного фрагмента ДНК в составе векторных молекул.

Для лигазной цепной реакции используют другой фермент — термостабильную ДНК-лигазу.

Наиболее универсальным методом амплификации служит NASBA-метод. В отличие от ПЦР, он осуществляется при температуре 41 °С, т. е. является изотермальным. Кроме того, в этом методе используют другие ферменты: РНК-полимеразу фага Т7, РНКазу Н и обратную транс-криптазу вируса птичьего миелобластоза. Метод крайне чувствительный, его можно использовать для контроля пищевых продуктов, в медицинской диагностике, в судебно-медицинской практике.

Введение нового (рекомбинантного) гена в клетку

Введение нового гена в клетку можно провести двумя способами: используя вектор или путем прямого введения.

Вектор — молекула ДНК или РНК, способная переносить включенные в нее чужеродные гены в клетку, где эти молекулы реплицируются автономно или после интеграции с геномом (хромосомой). Не каждая молекула ДНК или РНК может быть вектором.

Векторы должны обладать определенными свойствами, в числе которых:

1) способность к автономной (т. е. независимо от хромосомы реципиента) репликации в клетке реципиента. Например, для репликации в клетке бактерии вектор должен содержать сайт ori (участок инициации репликации);

2) наличие области, в которую возможно встраивание необходимого фрагмента ДНК. Для этого вектор должен содержать один или более участков (сайтов рестрикции), чувствительных к определенным рестриктазам, которые расщепляют вектор и позволяют встроить желаемую последовательность нуклеотидов (трансген);

3) небольшой размер, так как при длине более 15 т. п. незначительно снижается эффективность клонирования чужеродной ДНК;

4) наличие маркерных генов, позволяющих отличить трансформированные клетки от исходных. Это могут быть селективные (придающие клеткам устойчивость к антибиотикам, гербицидам) или репортерные (клетки удобно тестировать по изменению окраски продуктов этих генов) гены;

5) наличие соответствующего промотора, под которыйнеобходимо поместить чужеродный ген для экспрессии в клетке бактерии.

Последовательности ДНК, расположенные перед началом структурного гена и определяющие степень активности РНК-полимеразы, называются регуляторными последовательностями. Одна из таких последовательностей представляет собой участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза. Этот участок называется промотором.

Регуляторные последовательности эукариотических генов отличаются от прокариотических, и бактериальная РНК-полимераза не узнаёт их. Поэтому для экспрессии эукариотических генов в клетках прокариот нужно, чтобы гены находились под контролем бактериального промотора (т. е. промотора клетки-хозяина). В качестве промотора широко используют промотор гена, локализованного в коммерческих векторах, например pBR322, lac-промотор Е. coli и др.

Таким образом создается вектор, т. е. создается целая генетическая конструкция, в состав которой, помимо трансгена, вводятся маркерные гены и соответствующие регуляторные последовательности.

Типы векторов. В качестве векторных молекул могут служить плазмиды бактерий или дрожжей (простых эукариотических организмов), ДНК бактериофагов или вирусов, искусственные хромосомы дрожжей (YAK) и бактерий (ВАК). Созданы также гибридные (искусственные) векторы — фазмиды, объединяющие преимущества плазмид и фагов. Для клонирования небольших фрагментов ДНК используют плазмиды, фаговые ДНК, а для крупных — космиды и искусственные хромосомы.

1. Плазмиды. Основой для создания вектора обычно служат бактериальные плазмиды. Это небольшие внехромо-сомные, автономно реплицирующиеся кольцевые молекулы ДНК, которые в количестве нескольких копий содержатся в клетках бактерий. Природные плазмиды часто содержат гены, полезные для бактерий: придающие устойчивость к антибиотикам и ионам тяжелых металлов (R-плазмиды); контролирующие способность разрушать различные трудно-разлагаемые токсические соединения (нафталин, камфару, толуол, ксилол, различные пестициды и др.); плазмиды биодеградации, или D-плазмиды.

Некоторые плазмиды за счет специфического сайта инициации репликации могут реплицироваться в клетках только одного вида бактерий; это так называемые плазмиды с узким спектром хозяев. Другие плазмиды, с менее специфичным сайтом, могут реплицироваться в клетках разных видов бактерий; это плазмиды с широким спектром хозяев. Указанные особенности плазмид с успехом используют при создании векторов.

Однако есть свойства, которые не позволяют природным плазмидам выступать в качестве вектора. Так, их размер может достигать от 1 т. п. н. до 500 т. п. н., т. е. размер в большинстве случаев значительно превышает допустимый.

Кроме того, не все плазмиды несут в себе гены, которые могут служить маркерами для опознавания трансгенных клеток. Поэтому для эффективного трансгеноза приходится конструировать на основе плазмид с помощью методов генетической инженерии искусственные векторные системы (плазмидные векторы). В настоящее время предложен целый арсенал коммерческих векторов, созданных на основе бактериальных плазмид.

Например, плазмидный вектор pBR322 создан на основе плазмиды Е. соli. Плазмида pBR322 имеет сайт ori (область, ответственную за репликацию плазмиды), гены устойчивости к антибиотикам ампициллину и тетрациклину, причем в генах устойчивости к этим антибиотикам имеются сайты рестрикции. Если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику, так как при этом сохраняется устойчивость к другому антибиотику. То есть вектор дает возможность детектировать только те клоны бактерий, которые содержат рекомбинантную плазмиду.

Строение векторов может быть разнообразным, но все они обязательно должны включать в себя несколько сайтов для встраивания фрагментов донорной ДНК и обеспечивать простую идентификацию трансформированных клеток. В плаз-мидах можно клонировать фрагменты ДНК размером не более 10 т. п. н.

2. Вирусы — самые маленькие и самые простые из всех патогенов. Они являются одними из главных кандидатов на роль векторов для введения чужеродной ДНК. Из них создают векторы на основе РНК, вироидоспецифичных ДНК, комбинации вироидоспецифичных ДНК с Ti-плазми-дами. При вирусной инфекции каждая клетка может получить большое число копий чужеродного гена. ДНК можно встраивать так, чтобы она находилась под контролем сильного вирусного промотора, что обеспечит высокий уровень экспрессии гена, и его продукты будут более доступны для исследования. В генетической инженерии часто используют 35S-npoMOTop вируса мозаики цветной капусты. Этот промотор не обладает тканевой специфичностью и активен не только в клетках крестоцветных, но и в клетках растений других семейств. Вирус должен быть жизнеспособным после рекомбинирования его ДНК. Легче всего вирусы вводятся в бактерии. Недостаток вирусов как векторов заключается в их небольшой емкости. Кроме того, они заражают не большой круг хозяев.

Челночные векторы — это плазмидные векторы, предназначенные для работы в клетках разных организмов (животных и бактерий). Чаще всего для клонирования генов используют векторы с одним сайтом репликации для работы с Е. coli. При необходимости использования других бактерий или эукариотических клеток в векторы встраивают второй сайт инициации репликации, обеспечивающий их работу и в других клетках. Именно такие векторные системы называются челночными. Наиболее распространенные векторы состоят из плазмиды pBR322 и ин-тактногр раннего района транскрипции ДНК вируса SV40, а нужный ген встраивается под контроль промотора поздних генов или дополнительного раннего промотора. Челночные векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. Челночные векторы, созданные на основе бакуловирусов для работы в клетках Е. coli и насекомых, называются бакмидами.

4. Транспозоны — это сегменты ДНК, которые контролируют собственное перемещение из одного сайта ДНК в другой путем выхода из исходного сайта и внедрения в новый сайт хромосомы или плазмиды. Впервые транспозоны были открыты в 1940-х гг. американским ученым Барбарой Мак-Клинток у кукурузы. Транспозоны как бы передвигаются по всему геному растения. В течение многих лет кукуруза оставалась единственной системой, в которой обнаруживались такие подвижные генетические элементы. Сейчас они выявлены у бактерий, дрозофил и других организмов.

Механизм перемещения фрагментов ДНК по геному до конца не выяснен. Поскольку подвижные гены могут перемещаться в пределах генома с одного места на другое, то они могут быть весьма эффективными векторами для передачи рекомбинантной ДНК. Генетическая трансформация с помощью векторов на основе транспозонов была впервые осуществлена на дрозофиле. С их помощью можно переносить довольно крупные участки ДНК. Этот метод переноса генов имеет значительные преимущества, так как он осуществляется с высокой частотой и не сопровождается значительными перестройками в интегрируемой ДНК.

5. Векторные системы, предназначенные для клонирования крупных фрагментов ДНК:

— космиды — векторные системы, которые объединяют в себе участки плазмидных ДНК (ген-маркер и репликон плазмиды) и ДНК бактериофага. Термин обозначает, что вектор является плазмидой, внутри которой вставлен cos-участок фага A, (cos-site), представляющий собой нукле-отидную последовательность, отвечающую за упаковку фаговой ДНК в ее протеиновую капсулу. Космиды могут переносить до 40 т. п. н. клонируемой ДНК в клетки Е. coli;

— фазмиды — векторы, которые также представляют собой искусственные гибриды между фагом и плазмидой. В зависимости от условий, после встраивания чужеродной ДНК они могут размножаться как фаги или как плазмиды;

— бактериальная искусственная хромосома (ВАС — от англ. bacterial artificial chromosomes) — также способна переносить участки чужеродной ДНК от 150 до 300 т. п. н. Служит для трансформации животных клеток;

— дрожжевая искусственная хромосома (YAC — от англ. yeast artificial chromosomes) — сконструирована для переноса особо крупных участков чужеродной ДНК, вмещающих фрагменты геномной ДНК длиной от 100 т. п. н. до 1 м. п. н. Для их создания к плазмиде дрожжей «пришивают» центромерные последовательности, теломеры, последовательности для автономной репликации в дрожжевой клетке, сайты рестрикции и селективные маркеры.

В качестве возможных векторов для переноса генов предполагается использовать хлоропластные и митохондриальные ДНК.

Для идентификации трансформированных клеток, несущих рекомбинантную ДНК, вектор должен содержать один или несколько генов-маркеров. Выделяют две группы маркерных генов, позволяющих отличить трансформированные клетки от исходных, — это селективные и репортерные гены:

— селективные гены — придают клеткам селективное преимущество, т. е, устойчивость к антибиотикам (канами-цину, тетрациклину, неомицину и др.) или гербицидам (у растений). Основной принцип работы такого маркера — способность трансформированных клеток расти на селективной питательной среде с добавкой определенных веществ, ингибирующих рост и деление нетрансформирован-ных, т. е. нормальных, клеток. Трансформанты отбирают на средах с высоким содержанием этих веществ. Например, в присутствии гена лактомазы бактериальная клетка при обретает устойчивость к ампициллину и на среде с этим антибиотиком образует клон (несущий данный ген), тогда как обычные клетки (без данного гена) на этой среде погибают;

— репортерные гены — кодируют нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях легко обнаружить. В качестве репортерных чаще всего используют гены Р-глюкурони-дазы (uidA, другое название — gus), зеленого флюоресцентного белка (gfp), люциферазы (luc), хлорамфениколацетил-трансферааы (cat). Из них в большей степени применяют гены, кодирующие белки GUS и GFP, и в меньшей — кодирующие белки LUC и CAT.

Ген uidA (gus) является модифицированным геном из Е. coli, кодирующим (3-глюкуронидазу. Он может гидроли-зовать обширный спектр природных и синтетических глю-куронидов, что позволяет подбирать соответствующие субстраты для спектрофотометрического или флюориметрического определения активности фермента, а также для гистохимического окрашивания тканей in situ (в синий цвет). В составе химерных белков, созданных генно-инженерными методами, GUS обычно сохраняет свою функциональную активность.

GFP (green fluorescent protein — зеленый флюоресцентный белок) был обнаружен Т. Шимомурой и соавторами в 1962 г. у люминесцирующей медузы Aequorea victoria. Он обладает особым свойством — способен флюоресцировать в видимой (зеленой) области спектра при облучении длинноволновым УФ. Для проявления флюоресценции не требуется субстратов или кофакторов. Ген gfp был клонирован в 1992 г. Г. Прашером и соавторами. Благодаря свойству белка, gfp является очень перспективным репортерным геном, позволяет проводить разнообразные прижизненные (недеструктивные) исследования с трансгенными организмами. Определяется гистохимически, по изменению окраски ткани при добавлении соответствующего субстрата.

Ген luc кодирует фермент люциферазу (клонирована из бактерий и светлячка). Люцифераза обеспечивает переход люциферинов из окисленной формы в основную, что вызывает свечение трансформированных клеток растений, накапливающих этот белок.

Ген cat отвечает за синтез хлорамфениколацетилтрансфе-разы (выделен из Е. coli). Этот фермент катализирует реакцию переноса ацетильной группы от ацетил-КоА к хлорам-фениколу. Определяется только радиоизотопными методами. Область применения селективных генов в основном связана с простым контролем трансгеноза. Репортерные гены позволяют выявлять (по возможности количественно) временные и пространственные особенности экспрессии данного конкретного гена (собственного или чужеродного). Присоединение репортерного гена к одной лишь промоторной области позволяет исследовать в «чистом виде» ее роль в регуляции экспрессии изучаемого гена на уровне транскрипции.

Методы прямого переноса генов в клетку

В качестве реципиентов, в геном которых встраиваются чужеродные гены, используют клетки культуры, эмбриональные клетки млекопитающих, дрозофилы, пронуклеусы млекопитающих; у растений — протопласты, изолированные клетки и ткани, микроспоры, незрелые зиготические зародыши, проростки.

Для введения генетического материала в клетки разных организмов применяют ряд общих методов прямого переноса, таких, как трансформация, электропорация, микроинъекция и др.

Трансформация — метод введения рекомбинантной ДНК в клетку благодаря увеличению проницаемости ее клеточной оболочки (вероятно, за счет локального разрушения последней). Клетки обрабатывают ледяным раствором СаС1₂, а затем выдерживают при температуре 42 °С в течение 1,5 мин.

Трансдикция — процесс переноса (передачи) бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. Общая трансдукция используется в генетике бактерий для картирования генома и конструирования штаммов.

Трансфекция — метод предполагает введение ДНК, адсорбированной на кристаллах фосфата кальция (кальциевый преципитат), в клетку путем фагоцитоза. Для трансфекции используют и ДЭАЭ-декстран — полимер, адсорбирующий ДНК. Эффект вхождения в клетки и время экспрессии высоки, но частота стабильной трансформации

Глава 4. Генетическая инженерия

ниже, чем при использовании преципитата кальция. Часто-. ту трансфекции увеличивает глицериновый шок (4 мин в 15%-м растворе глицерина в HEPES-буфере).

Электропорация — метод заключается в воздействии импульсов вьщокого напряжения электрического тока на клеточную мембрану, которое, скорее всего, вызывает временное образование большого количества пор, что обратимо увеличивает проницаемость мембран. Через образующиеся на короткое время поры чужеродная ДНК проникает в клетку. Это простой, эффективный и воспроизводимый метод. С его помощью были получены трансгенные растения кукурузы, риса и сахарного тростника.

Микроинъекции ДНК — метод позволяет с помощью тонких микроигл и микроманипулятора вводить в клетку или прямо в ядро векторную ДНК с включенным в нее трансгеном. С помощью микроинъекций осуществляется трансформация у дрозофилы и растений (ячмень, капуста). Метод, разработанный в начале 1970-х гг. А. Андерсоном и Г. Диакумакосом, дает небольшой выход трансформированных клеток. Его преимуществом является возможность вводить любую ДНК в любые клетки; кроме того, для сохранения в клетках введенного гена не требуется никакого селективного давления.

Упаковка в липосомы. Липосомы — сферические тельца, оболочки которых образованы фосфолипидами. Липосомы, содержащие внутри рекомбинантную ДНК, способны непосредственно сливаться с мембраной клетки или поглощаться клетками. В клетке происходит разрушение оболочки липосом и высвобождение ДНК. Это один из методов, позволяющих защитить трансформированный генетический материал от разрушения нуклеазами, присутствующими вне клеток. Метод применяется для введения нуклеиновых кислот в культивируемые животные клетки и растительные протопласты.