Мы поможем в написании ваших работ!



ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Пройти трансмембранную транслокацию - тоже еще во время трансляции - это чаще всего происходит на полирибосомах, которые закреплены на мембранах (след. Билет)

Поиск

 

46. Трансмембранная транслокация растуще­го полипептида. (Ишкова)

У прокариот связанные рибосомы находятся на внутренней поверхности мембраны, у эукариот - на ретукулуме. Эукариотическая 60S субъединица имеет специальный участок со сродством к мембране эндоплазматического ретикулума. Закрепление рибосомы на мембране происходит со стороны выхода межсубъединичного канала.

Такие рибосомы синтезируют либо белки, встраивающиеся в мембрану, либо секреторные белки, которые через мембраны транспортируются во внеклеточное пространство. В случае белков, предназначенных быть компонентами данной мембраны (мембраны эндоплазматического ретикулума у эукариот или плазматической мембраны у прокариот) гидрофобное окружение определяет способ их сворачивания, так что многочисленные гидрофобные остатки экспонируются на поверхность молекулы. Трансмембранные гидрофобные последовательности таких белков обычно существуют в α-спиральной конформации. В случае транспортирующихся через мембрану белков у эукариот растущая полипептидная цепь, проходящая через мембрану, претерпевает окончательное сворачивание в водной среде просвета эндоплазматического ретикулума.Трансмембранная транслокация таких полипептидов сопровождается их многостадийным сворачиванием, которое у эукариот сопряжено с котрансляционными ковалентными модификациями. Скорее всего, рибосомный канал работает именно здесь. Мембраны содержат специальные рецепторы, которые ответственны за обратимую ассоциацию рибосом с мембраной. По мере удлинения полипептида NAC может быть вытеснен из рибосомы 11S рибонуклеопротеидным комплексом, обозначаемым как «сигнал-узнающая частица» - SRP. SRP связывается с сигнальной последовательностью. Белок с сигнальной последовательностью - пребелок, сигналка потом отрезается (после того, как белок выбрасывают за клетку, или встраивают в мембрану или иным способом выполняют его функцию).

Сигнальные последовательности на N-конце растущей полипептидной цепи обычно составляют в длину от 15 до 30 аминокислотных остатков. В них можно различить три участка, в следующем порядке: короткий участок n на самом N-конце, в большинстве случаев положительно заряженный; гидрофобный участок h в середине сигнальной последовательности; консервативный участок с, предшествующий участку разрезания. Участок h, состоящий в основном из остатков Leu, Ala, Ile, Phe и Trp, составляет в длину 10±3 аминокислоты. В этом отношении он отличается от трансмембранных аминокислотных последовательностей (24±2 остатка) и от гидрофобных последовательностей внутренних районов глобулярных белков (6-8 остатков). Основными свойствами участка h является его полная гидрофобность и a-спиральная конформация. Аминокислотный состав участка с подчиняется так называемому «правилу -1, -3», в соответствии с которым положение –1, обозначающее место разрезания цепи, должно быть занято одним из нижеперечисленных аминокислотных остатков - Ala, Ser, Gly, Cys, Thr или Gln,- а в положении -3 не должно находиться ароматических (Phe, His, Tyr, Trp), заряженных (Asp, Glu, Arg, Lys) или крупных гидрофильных (Asn, Gln) остатков. Кроме того, в положениях от -3 до +1 не должно находиться остатков пролина. Некоторые интегральные мембранные белки имеют в своем составе сигнальные последовательности, не отщепляемые сигнальной пептидазой. Такие последовательности составляют в длину от 20 до 30 (обычно 23±3) гидрофобных и неполярных остатков, и со стороны N-конца им часто предшествует группа положительно заряженных остатков. Белки с такими неотщепляемыми сигналами ко-трансляционно импортируются в эндоплазматический ретикулум с участием SRP, SRP-рецептора и того же самого аппарата транслокации, как и в случае белков с отщепляемыми сигнальными последовательностями. Однако, в данном случае протеолитического расщепления растущей цепи не происходит - прежде всего, в связи с отсутствием участка разрезания, удовлетворяющего «правилу -1, -3», - и завершенная полипептидная цепь не покидает мембрану.

Если растущий полипептид содержит сигнальную последовательность, рибосома с растущей цепью взаимодействует с SRP в цитоплазме. Образующийся комплекс, в котором элонгация синтезируемого пептида запрещена присутствием SRP, мигрирует в цитоплазме до тех пор, пока не найдет специфический рецептор (SRP-рецептор), обозначаемый как SR, на поверхности эндоплазматического ретикулума. Взаимодействие с SR приводит к освобождению рибосомы с растущей полипептидной цепью из комплекса с SRP и внедрению растущей цепи в трансмембранный транслокационный канал; трансляция восстанавливается.Затем сигнальная последовательность либо отщепляется специфической эндопептидазой (сигнальной пептидазой), либо встраивается в мембрану эндоплазматического ретикулума.

У эукариот SRP представляет собой стержневидную рибонуклеопротеидную частицу, имеющую 5-6 нм в ширину и 23-24 нм в длину (11S РНП). Она состоит из одной молекулы 7S РНК и шести белковых субъединиц с молекулярными массами от 9 до 72 кДа и обозначаемых, соответственно, как SRP9, SRP14, SRP19, SRP54, SRP68 и SRP72. Четыре из них образуют два гетеродимера - SRP9/14, расположеннего на участке 7S РНК вблизи концов полинуклеотидной цепи, и SRP68/72 в центральной части частицы, тогда как две оставшиеся субъединицы - SRP19 и SRP54 - существуют в виде мономеров, сидящих на смежных спиралях РНК на другом конце частицы. 7S РНК, образующая структурный остов SRP, четко подразделяется на два основных функциональных домена – так называемые Alu-подобный домен и S-домен. При присоединении к рибосоме домен S контактирует с большой рибосомной субъединицей в месте выхода сигнального пептида и связывается с сигнальной последовательностью, тогда как домен Alu достигает фактор-связывающего участка большой субъединицы и, по-видимому, ответственен за остановку. Субъединица-мономер с молекулярной массой 54 кДа (SRP54), ассоциированная с S-доменом, является, по-видимому, функционально наиболее важной. Прежде всего, именно SRP54 непосредственно связывается с растущим полипептидом через его сигнальную последовательность. Эта белковая субъединица слагается из трех структурных доменов – N-концевой домен (SRP54N), представляющий собой пучок из четырех a-спиралей, серединный домен, содержащий ГДФ/ГТФ-связывающий и ГТФазный центр (SRP54G), и С-концевой сигнал-связывающий a-спиральный домен (SRP54М). С-концевой домен (SRP54М), взаимодействующий с сигнальной последовательностью, включает в себя три a-спирали, обогащенные остатками метионина. Предполагается, что эти спирали формируют пептид-связывающий желоб на поверхности SRP54М, и метиониновые остатки, которые по гибкости своих боковых групп уникальны среди гидрофобных аминокислот, обеспечивают возможность взаимодействия с множеством сигнальных последовательностей, различных по составу и структуре. Субъединица SRP54 прикреплена к S-домену 7S РНК тоже через свой С-концевой домен М, который имеет специфический РНК-связывающий участок.

SRP характерны и для бактериальных клеток, но бактериальные частицы гораздо меньше по размерам, чем эукариотические SRP, и состоят только из 4,5S РНК, представляющей собой укороченную версию 7S РНК, лишенную Alu-домена, и гомолога SRP54, обозначаемого как Ffh или р48. В соответствии с этим, комплекс 4,5S РНК/Ffh, представляющий собой бактериальную SRP, способен лишь связывать растущие цепи с сигнальными последовательностями на рибосоме, но не может останавливать элонгацию, скорее всего, по причине отсутствия Alu-домена и связывающихся с ним белковых компонентов.

Взаимоотношения между рибосомой с растущей цепью, SRP и SR регулируются связыванием ГТФ и его гидролизом в ГТФазных центрах этих трех компонентов. Свободные SRP содержат ГДФ. Замена ГДФ на ГТФ в SRP54G индуцируется, по-видимому, присоединением SRP к транслирующей рибосоме. SRP с субъединицей SRP54G в ГТФ-индуцированной конформации находит SR на мембране эндоплазматического ретикулума и связывается с его субъединицей SRa. Взаимодействие SRP с SRa вызывает гидролиз ГТФ - по-видимому, в обоих компонентах комплекса. В результате компоненты комплекса - SRP54G и SRa - переходят в «расслабленную» (relaxed) ГДФ-конформацию, теряют сродство друг к другу, и комплекс диссоциирует. SRP с субъединицей SRP54G в «релаксированной» ГДФ-конформации покидает рибосому и мембрану, а рибосома со свисающим с нее полипептидом оказывается захваченной другой мембранной структурой, обозначаемой как транслокационный, или пептид-проводящий канал, иногда также называемый транслоконом. Когда рибосома с полипептидной цепью освобождается от SRP и взаимодействует с мембраной эндоплазматического ретикулума, возобновляется элонгация, и растущая цепь проникает в транслокационный канал.

Транслокационный канал в мембране образуется гетеротримерным белковым комплексом, обозначаемым как Sec61p у эукариот или SecY у эубактерий и архей. Его основным функциональным ядром является a субъединица (Sec61a или SecYa) с молекулярной массой около 40 кДа, с которой ассоциированы две небольшие вспомогательные субъединицы - b (14 кДа) и g (8 кДа). Sec61a или SecYa– это трансмембранный белок; полипептидная цепь которого пересекает мембрану 10 раз, соответственно образуя 10 трансмембранно расположенных a-спиральных участков, собранных в цилиндр или «боченок» высотой около 45 Å и диаметром до 100 Å. Спирали 1 – 5 и спирали 6 – 10 образуют, соответственно, две компактные половинки («створки») молекулы белка, соединенные неспирализованным участком цепи (шарнирной петлей) между спиралью 5 и спиралью 6; каждая половинка состоит из двух внутренних и трех внешних спиралей. По другую от шарнира сторону цилиндра («боченка») крайние спирали половинок несколько разнесены, и эта открытая сторона белка оказывается непосредственно обращенной в липидный слой мембраны. В самом узком месте располагается «пробка», перекрывающая канал и разделяющая его на две части – цитоплазматическую и внешнюю по отношению к цитоплазме, но тоже с водным наполнением. «Пробка» представляет собой небольшую a-спиральку 2а, отделенную от спирали 2 гибкой перемычкой и способную выходить из сужения, открывая пору диаметром 5-8 Å в середине канала. Сужение канала – пора – выстлана по периметру кольцом из семи изолейциновых (иногда с участием валиновых) остатков, которые создают гидрофобную прокладку («сальник») вокруг транлоцирующегося полипептида.Экспериментальные данные показывают, что пора канала открывается в ответ на связывание сигнальной последовательности полипептида. Вхождение в открытую пору участка полипептидной цепи за сигнальной последовательностью фиксирует канал в открытом состоянии, препятствуя «пробке» вернуться на место и заткнуть пору. «Пробка» может вернуться и закрыть пору только после того, как полипептидная цепь покинет канал. При транслокации полипептида, представляющего белок, встроенный в мембрану, гидрофобные трансмембранные спирали растущего полипептида могут выходить из канала латерально через разъем между двумя половинками Sec61a непосредственно в липидную фазу мембраны. Это – так называемые латеральные ворота канала.

Исходно трансмембранный канал закрыт, так как небольшая спираль, подвижно сочлененная с a-спиралью 2, ассоциирована с порой в средней узкой части канала, играя роль «пробки», или «затычки». (2) С цитоплазматическим входом канала - с петлями, соединяющими спирали 6 и 7 и спирали 8 и 9, и с С-концевым хвостом - взаимодействует транслирующая рибосома, несущая полипептид с сигнальной последовательностью. Это взаимодействие индуцирует конформационное изменение a-субъединицы канала, приводящее к дестабилизации закрытого состояния канала, но еще не к полному его открыванию. (3) N-концевой положительно заряженный сегмент сигнальной последовательности заякоривается на отрицательно заряженной цитоплазматической поверхности мембраны, а ее гидрофобная часть погружается (интеркалируется) в стенку канала между спиралями 2 и 7 (т.е. фактически уже входит в латеральные ворота). Это приводит к некоторому раздвиганию половинок субъединицы Sec61a (или SecYa) в районе между спиралями 2 и 7, что окончательно открывает канал, и петля пост-сигнальной части полипептида вставляется в пору. (4) Сигнальная часть полипептида отрезается сигнальной пептидазой, и полипептид по мере его синтеза продвигается через канал к просвету эндоплазматического ретикулума или внешней стороне мембраны. Гидрофобное кольцо («сальник») поры вокруг полипептидной цепи не дает другим молекулам проходить через пору и канал в процессе продвижения полипептида из водной среды цитоплазмы в водную среду просвета или внешней стороны мембраны. (5) Терминация трансляции приводит к освобождению полипептида в просвет ретикулума и к его сворачиванию в глобулярный белок.

 

 

47. Котрансляционная и посттрансляционна­я трансмембранная транслокация новосинте­зированного белка у грам-отрицательных б­актерий (Кульчицкая)
Для транспорта бактериальных белков на мембрану или сквозь нее используются оба механизма транслокации: котрансляционный и посттрансляционный. Вспомним, что у грам – бактерий оболочка состоит из 2х мембран, между которыми располагается периплазма. Дальнейшая судьба белков, экспортируемых из цитоплазмы: 1) встраивание во внутреннюю мембрану 2) перенос через внутр. мембрану в периплазму 3) встраивание во внеш. мембрану 4) перенос через внеш. мембрану во внеш. среду. На внутр. мембране бактериальной оболочки разные белковые комплексы отвечают за транспорт белков, проходящих сквозь мембрану, и белков, интегрирующих в мембрану. Некоторые белки секретируются и ко- и посттрансляционно, при этом баланс двух процессов определяется относительной V трансляции со V переноса через мембрану. Экспортируемые бакт. белки имеют N-концевую лидерную последовательность с гидрофильным N-концом и прилегающим к нему гидрофобным ядром. Лидерная пос-сть отщепляется сигнальной пептидазой, узнающей предшественников нескольких экспортируемых белков. Сигнальная пептидаза- мембранный белок, у бактерий на внутр. мембране сидит. Несколько генов под названием sec кодируют компоненты секреторного аппарата. Мутации в них → блок секреции многих экспортируемых белков.

Лучше всего изучена система Sec (система транспорта белков через внутр. мембрану оболочки бактерий), она представляет собой SecYEG транслокон, встроенный в мембрану: SecA проталкивает транспортируеые белки через канал, SecB - шаперон, который переносит растущую полипептидную цепь к SecA, сигнальная пептидаза отщепляет N- концевую сигнальную последовательность от переносимого через мембрану белка. Существует два основных пути доставки белка в канал Sec: 1) шаперон SecB 2)SPR на основе 4,5S РНК. Несколько шаперонов могут повышать эффективность экспорта бактериальных белков, предотвращая их преждевременное сворачивание (среди них GroEL, а также SecB). Во-первых, SecB действует как шаперон, связывая растущий полипептид и тормозя его фолдинг. Во-вторых, он характеризуется сродством к SecA, что позволяет ему направлять предшественник белка к внутренней мембране бактериальной клетки. В частности, путь SecB –SecYEG используется для транслокации белков, секретируемых в периплазму. SecA – большой примембранный белок, взаимодействующий с внутренней мембраной несколькими способами. SecA обладает АТФазной активностью. После того, как SecA связался с предшественником белка, он связывает АТФ и проталкивает примерно 20 аминокислот сквозь мембрану. Для диссоциации SecA от транспортируемого белка необходим гидролиз АТФ. Затем цикл снова повторяется. Рибонуклеопротеиновый комплекс 4,5S РНК с белками Ffh и FtsY –аналог эукариотичекой SRP.



Поделиться:


Последнее изменение этой страницы: 2016-08-16; просмотров: 500; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 18.225.55.42 (0.009 с.)