Концевой трнк-подобный домен рнк растительных вирусов

3'-Концевые тРНК-подобные домены вирусных РНК способны взаимодействовать с клеточными аминоацил-тРНК-синтета-зами и аминоацилирования с их помощью, как и настоящие тРНК. Специфич-ность аминоацилирования различна для разных вирусных РНК. Так, 3'-конец РНК вируса табачной мозаики (ВТМ) (рис. 14.19) специфически взаимодейству-ет с гистидиновой аминоацил-тРНК-синтетазой и соответственно ацилируется гистидином. Подобным же образом РНК вируса желтой мозаики турнепса ацилируется валином, а РНК вируса мозаики костра — тирозином. Роль 3'-концевых тРНК-подобных доменов и ацильных остатков на 3’-концах вирусных РНК в трансляции не ясна.

 

 

42. Маскирование – демаскирование мРНК.­ (Тарлычева)

Маскирование мРНК - вариант трансляционного контроля. Прим: матрицы, синтезированные во время оогенеза и сперматогенеза, которые оч.долго хранятся. Они защищены от инициации трансляции, деградации и поли/деаденилирования.

В ооцитах и сперматоцитах за маскирование отвечает 3'-НТО(было доказано при обработке маскированной мРНК антисмысловыми последовательностями, комплементарными к средней части 3'-НТО и удалением всей этой части. Позже был обнаружен белок "маскирующий эл-нт" в составе 3'-НТО мРНК малой субъединицы рибонуклеотидредуктазы, присутствие которого кореллирует с отсутствием/началом транскрипции. Это первичный маскирующий белок, который инициирует процесс маскирования, при этом блокируется кэп-структуру на 5' конце. В него также входят молекулы основного РНП-образующего белкаМаскирование материнских мРНК в ооцитах сопровождается укорочением их поли-А хвостов, что также сильно уменьшает их потенциальную способность к трансляции. В этом также участвует большое количество молекул основного РНП-образующего белка YB (Y-box proteins). Демаскирование индуцируется фосфорилированием первичного маскирующего белка и связанных с ними белков, что приводит как к освобождению кэп-структуры, так и к стимуляции полиаденилилирования мРНК цитоплазматической поли(А)-полимеразой и восстановлению длинного поли(А)-хвоста, необходимого для эффективной трансляции.

В сперматогенезе транскрипция прекращается во время мейоза или на ранних пост-мейотических стадиях, а трансляция мРНК, кодирующих основные белки сперматозоидов (такие как протамины), задерживается на много дней.

Демаскирование мРНК в раннем эмбриогенезе. Самые ранние стадии – дробление, бластула, иногда начало гаструляции – обеспечиваются целиком запасенной материнской мРНК; ядро в этот период еще не активно в транскрипции и транспорте мРНК в цитоплазму, так что может быть даже удалено без последствий для этого начального периода эмбриогенеза. В дальнейшем, когда ядра в клетках ранних эмбрионов начинают выдавать ново-синтезированную мРНК, наблюдается явление периодичности работы клеточного ядра: мРНК поступает из ядра в цитоплазму порциями и каждая порция поступает в маскированном виде. «Отработавшие» мРНК в цитоплазме обычно тем или иным способом «выключаются» и затем подвергаются деградации, но в ряде случаев переходят в маскированную форму и хранятся в клетках до следующего периода их активности.

Ранний эмбриогенез лягушки. Основным элементом 3¢-НТО мРНК, ответственным за маскирование является U-богатый участок с консенсусной последовательностью UUUUAU, обозначаемый как CPE (Cytoplasmic Polyadenylation Element), который участвует также в индукции деаденилирования (при маскировании) и полиаденилирования (при демаскировании) хвоста мРНК в цитоплазме. Имеет специфическое сродство к белку СРЕВ («CPE-Binding protein»), первичный маск. белок. Связывание СРЕВ с СРЕ индуцирует присоединение белка Maskin к 3¢-НТО-связанному CPEB. Белок Maskin, сидящий на белке СРЕВ, имеет сильное сродство к малой - кэп-связывающей - субъединице фактора инициации eIG4F (eIF4E) и, взаимодействуя с ней, блокирует механизм кэп-зависимой инициации трансляции (рис. 16.9). В процессе демаскирования фосфокиназы фосфорилируют белок СРЕВ, в результате чего связанный с ним белок Maskin теряет сродство к eIF4E, и, таким образом, происходит разблокирование кэп-зависимой инициации трансляции.

На некотором расстоянии от СРЕ по направлению к 3¢-конце мРНК расположен другой структурный элемент 3¢-НТО – гексануклеотидная последовательность AAUAAA, на которой собирается белковый комплекс, непосредственно участвующий в деаденилировании и полиаденилировании хвоста мРНК. В состав этого комплекса входят, в частности, мультисубъединичный белок («Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor», CPSF), связанный с AAUAAA, деаденилирующий фермент – поли(А)-специфическая рибонуклеаза (PARN), и поли(А)-полимераза (Gld2). При маскировании именно поли(А)-специфическая рибонуклеаза укорачивает поли(А)-хвост мРНК. При демаскировании, в ответ на соответствующую стимуляцию, происходит активация фосфокиназы, которая фосфорилирует первичный маскирующий белок СРЕВ. Фосфорилированный СРЕВ взаимодействует с вышеуказанным комплексом на AAUAAA, что приводит к удалению из комплекса поли(А)-специфической рибонуклеазы PARN и к полиаденилированию (удлинению) хвоста поли(А)-полимеразой Gld2.

Маскирование и демаскирование мРНК в процессе клеточной дифференцировки Наиболее полно изученный случай во время финальных стадий клеточной дифференцировки – мРНК, кодирующая эритроидную l5-липоксигеназу (LOX) (рис. 16.12). LOX мРНК синтезируется на ранних стадиях эритропоэза, становится маскированной, вплоть до поздней стадии периферических ретикулоцитов. Демаскирование LOX мРНК и синтез происходят во время созревания ретикулоцитов до эритроцитов. Длинная 3¢-НТО ретикулоцитной LOX мРНК содержит характерную последовательность, в которой обогащенный пиримидинами (в основном цитидиловыми остатками) мотив из 19 нуклеотидов повтор.10 раз, является ответственным за маскирование LOX мРНК посредством взаимодействия с hnRNP-К и hnRNP-Е1. Указанные белки являются компонентом трансляционно неактивного LOX мРНП в кл. костного мозга и ретикулоцитах. LOX-BP способны избирательно ингибировать трансляцию гибридных (химерных) чужеродных мРНК и функционируют не зависимо от наличия кэп-структуры, так что в данном случае в процесс маскирования не вовлечены механизмы прямого воздействия с кэп-связывающим белком eIF4E.

Участие микроРНК в маскировании мРНК МикроРНК в клетках образуются из специальных некодирующих транскриптов, формирующих длинные двуспиральные шпильки с многочисленными боковыми петлями. В ядре происходит выщепление укороченной шпильки из более длинного транскрипта. После транспорта в цитоплазму шпилька связывается с мультидоменной эндонуклеазой «Dicer», которая вырезает двуспиральный участок длиной около 22-24 нуклеотидных пар. Этот дуплекс расплетается хеликазой, и одна из цепей, представляющая собой зрелую микроРНК, передается от Dicer на белковый комплекс, обозначаемый как «RISK» (RNA-Induced Silencing Complex), а комплементарная цепь освобождается и разрушается. Основой комплекса RISK является крупный (около 100 кДа) белок, обозначаемый как «Argonaute»; именно с ним оказывается связанной цепь микроРНК. МикроРНК в комплексе с RISK (белком Argonaute) взаимодействует с полностью или частично комплементарными участками в 3¢-НТО молекул мРНК, что приводит к инактивации этих мРНК (рис. 16.13). В случаях полной комплементарности на протяжении всей длины микроРНК эндонуклеазный домен белка Argonaute расщепляет цепь мРНК в месте комплементарного взаимодействия, что индуцирует деградацию данной мРНК. Именно таким образом действуют малые интерферирующие РНК (siRNA), комплементарные участкам кодирующей части мРНК (см. рис. 16.13). Однако, при неполной комплементарности участка 3¢-НТО и микроРНК расщепления не происходит, и белок Argonaute остается привязанным к 3¢-НТО мРНК через микроРНК. Эта ситуация, типичная для клеток животных, приводит к прекращению трансляции данной мРНК посредством еще не исследованного механизма.

 

 

43. Терминация трансляции. Механизм реак­ции терминации трансляции в рибосоме. По­следовательность событий в процессе терм­инации трансляции. (Тарлычева)

Кодоны терминации UAA, UAG, UGA - это стоп-кодоны. Иногда встречаются даже тандемы стоп-кодонов; приблизительно каждый из стоп-кодонов в одном случае из ста имеет за собой второй стоп-кодон. Контекст терминирующих кодонов может влиять на эффективность терминации. У эукариот за кодоном терминации часто следует пуриновый нуклеотид - UAA(A/G) и UGA(A/G). Вне корректной рамки считывания триплеты UAA, UAG и UGA встречаются гораздо чаще, чем в рамке считывания, где имеется один терминирующий кодон на всю кодирующую нуклеотидную последовательность. Поэтому обычно случайный сдвиг рамки не может привести к синтезу неправильного полипептида заканчивается скорой терминацией. В некодирующих участках частота терминирующих триплетов обычно также высока.

Из трех кодонов самым «слабым» считается UGA: он чаще всего может «проскакиваться» транслирующей рибосомой за счет его узнавания триптофановой тРНК. В митохондриях млекопитающих и грибов кодон UGA не является терминирующим; он кодирует триптофан, как и кодон UGG. С другой стороны, в митохондриях позвоночных кодоны AGA и AGG не кодируют аргинин, а служат терминирующими.

Белковые факторы терминации Когда терминирующий кодон оказывается в А участке рибосомы, он узнается специальными растворимыми белками, которые связываются с рибосомой и индуцируют гидролиз сложноэфирной связи между тРНК и полипептидом молекулы пептидил-тРНК в Р участке. В результате этого полипептид освобождается из рибосомы. Белки, узнающие кодоны терминации и индуцирующие освобождение полипептида, называют факторами терминации, или RF (Release Factors). Факторы терминации трансляции принято подразделять на два класса – 1 и 2.

Факторы терминации класса 1

К классу 1 относятся белки, декодирующие кодоны терминации и индуцирующие гидролитическое расщепление пептидил-тРНК на полипептид и тРНК. У прокариот к этому классу относят RF1 и RF2. Кодон UAA узнается обоими белками, кодон UAG – только RF1, а кодон UGA – только RF2. Митохондрии млекопитающих не содержат белка RF2, так как в них не используется стоп-кодон UGA. У эукариот и архей все три терминирующих кодона узнаются единственным фактором класса 1, eRF1 и aRF1, соответственно.

Состоят из трех гибко сочлененных структурных блоков. У эукариот белок eRF1 подразделяется на N-концевой домен (N), серединный домен (М) и С-концевой домен (С). У эубактерий структурными модулями белка, функционально эквивалентыми вышеуказанным, являются, соответственно, (1) домен 2 с тесно примыкающим доменом 4, образующими фактически один структурно слитый супердомен 2+4, (2) вытянутый домен 3 с петлей на дистальном конце, и (3) боковой a-спиральный домен 1.

Факторы терминации класса 2 К классу 2 терминирующих факторов относятся белки RF3 прокариот и eRF3 эукариот. Эти белки имеют общее свойство – после связывания с рибосомой они, как и факторы элонгации, осуществляют гидролиз ГТФ до ГДФ и неорганического фосфата. При этом для осуществления гидролиза эубактериальный RF3 не строго нуждается в факторе класса 1, а эукариотический eRF3 обязательно требует присутствия eRF1. Фактор eRF3 кодирован незаменимым геном, тогда как без гена, кодирующего RF3, бактерии обходятся.

Оба фактора – эубактериальный RF3 и эукариотический eRF3 – имеют структурное сходство друг с другом, а также с факторами элонгации, и особенно с EF-Tu и eEF1А. Как и указанные факторы элонгации, факторы терминации класса 2 состоят из трех глобулярных доменов, и домен I является ГТФ/ГДФ-связывающим, а два других домена b-структурного типа формируют вторую половину молекулы, подвижно связанную с доменом I. По-видимому, и механизм действия фактора терминации класса 2 подобен таковому фактора элонгации EF-Tu или eEF1А, но вместо аминоацил-тРНК фактор терминации в ГТФ-форме взаимодействует с фактором терминации класса 1.

Фактор «повторного использования рибосомы», или RRF (RF4) У эубактерий в дополнение к факторам терминации класса 1 (RF1 и RF2) и класса 2 (RF3) в процессе терминации участвует и еще один белок, названный «фактором повторного использования рибосомы», или RRF (Ribosome Recycling Factor) = RF4. Необходим для освобождения деацилированной тРНК из рибосомы после завершения основной стадии терминации – гидролитическоно расщепления сложноэфирной связи пептидил-тРНК и освобождения синтезированного полипептида. Небольшой оснóвный белок, трехмерная структура сильно напоминает таковую L-образной молекулы тРНК и поэтому некоторое время считалось, что он имитирует молекулу тРНК, чтобы вытеснить из Р участка рибосомы деацилированную тРНК. Все попытки найти фактор, гомологичный RRF, у эукариот и архей до сих пор не увенчались успехом.

Общий сценарий последовательности событий в процессе терминации. Терминация трансляции включает в себя несколько последовательных шагов, на основании знания которых можно представить предположительный сценарий последовательности всех событий в ходе терминации.

1) связывание фактора терминации класса 1 eRF1 у эукариот – с вакантным А участкомрибосомы и узнавание терминирующего кодона, установленного там в результате полного прочтения кодирующей части мРНК.

2) гидролиз ГТФ и освобождение RF3/еRF3.

3) гидролиз сложноэфирной связи пептидил-тРНК в р -участке ПТЦ и освобождение полипептидной цепи из рибосомы.

4) известный только для терминации у эубактерий - связывание «фактора повторного использования рибосомы» RRF и фактора элонгации EF-G с ГТФ.

5) гидролиз ГТФ, освобождение EF-G, эвакуация деацилированной тРНК и диссоциация терминирующей рибосомы на субъединицы.

Ассоциация двух рибосомных субъединиц в вакантной рибосоме гораздо слабее, чем в рибосоме, несущей лиганды, и, следовательно, освобождение лигандов способствует обратимой диссоциации субъединиц. RRF, нарушая один из главных межсубъединичных контактов, в еще большей степени вынуждает рибосому диссоциировать на субъединицы. В результате диссоциации большая рибосомная субъединица уходит, а малая субъединица может некоторое время оставаться в лабильной связи с мРНК и скользить вдоль нее, вплоть до ее диссоциации от мРНК или ре-инициации трансляции на следующем цистроне, либо, в случае нековалентной циклизации мРНК, ре-инициации на той же матрице. Малая рибосомная субъединица, диссоциировавшая от мРНК, взаимодействует с факторами инициации и с их помощью входит в новый раунд трансляции.

Пост-терминационные стадии у эукариот почти не изучены, ни об аналоге «фактора повторного использования рибосомы» RRF, ни об участии фактора элонгации типа EF2 с ГТФ на стадиях вслед за гидролизом пептидил-тРНК в эукариотических рибосомах сведений нет.

 

 

44. Трансляционные паузы (Мартынова).­

Экспериментальные результаты, свидетельствующие о неравномерной скорости трансляции, были получены при синтезе разных белков как в интактных клетках, так и в бесклеточных системах (синтез белка оболочки фага MS2 в E. coli, фиброина шелка, вителлогенина, сывороточного альбумина, препролактина, препроинсулина, проколлагена, глобиновых цепей в ретикулоцитах и др.) Это указывает на возможность периодического замедления движения или остановок в процессе трансляции. Во время элонгации рибосомы двигаются вдоль цепи мРНК с непостоянной скоростью, и в некоторых случаях могут происходить более или менее длительные паузы. Паузы могут быть регулируемыми, поэтому общая продукция белка может контролироваться удлинением/укорочением паузы. Кроме того, паузы во время элонгации могут стимулировать сдвиг рамки на участке задержки. Паузы также важны при:

l ко-трансляционном сворачивании белков - пауза после завершения синтеза структурно автономной или полуавтономной части синтезируемого белка обеспечит задержку синтеза следующей части несвернутой цепи и предоставит время для самосворачивания завершенной части на рибосоме;

l ко-трансляционной сборке больших белков или мембранных белковых комплексов - например, элонгация белка D1 реакционного центра хлоропластов, связывание кофакторов (хлорофилл) с D1;

l ко-трансляционном трансмембранном транспорте - ко-трансляционное встраивание белка D1 в тилакоидную мембрану;

Механизмы трансляционных пауз:

l недостаток определенных аминоацил-тРНК (ожидание прихода редкой (минорной) тРНК из окружающей среды = задержка движения рибосомы на кодонах; у E.coli редкие аргининовые кодоны CGA и CGG, изолейциновый AUA, лейциновый CUA и др.). Редкие кодоны (соответствующие минорной тРНК) называют модулирующими кодонами - регулируют скорость трансляции;

l на пути рибосомы встречаются тандемы редких кодонов (особенно, если два или более редких кодона подряд должны узнаваться одной и той же минорной тРНК). Это легко объяснимо: первый редкий кодон связывает «свою» минорную аминоацил-тРНК в А участке рибосомы, и затем этот кодон вместе с тРНК транслоцируется в Р участок, так что рибосома уводит эту, и так редкую, аминоацил-тРНК из своего непосредственного окружения; в результате опустевший А участок со очередным редким кодоном вынужден ждать еще более редкого шанса случайного подхода такой же аминоацил-тРНК. Получается длинная пауза в элонгации;

l структурные барьеры на мРНК (стабильные шпильки, псевдоузлы, третичная структура);

l ингибиторные аминокислотные последовательности растущих пептидов;

l обнаружен ряд регуляторных белков, которые после взаимодействия с транслирующей рибосомой избирательно временно задерживают трансляцию в определенных местах мРНК. Например, у эукариот есть рибонуклеопротеиновая частица (сигнал-распознающая частица SRP – signal recognition particle), содержащая 7S-РНК, которая узнает особую N-концевую гидрофобную аминокислотную последовательность растущего полипептида, направляемого в ЭПР. Эта частица присоединяется к рибосомам и блокирует трансляцию.

45. Пути растущего полипептида.­ (Ишкова)

Растущий полипептид может дальше жить тремя способами: 1) свернуться в глобулу прямо во время трансляции (ко-трансляционное сворачивание): во время трансляции акцепторная и донорная аминокислота располагаются стандартным для всех ак образом - эта ориентация соответствует альфа-спирали в будущем. Т.О. после транспептидации новый полипептид должен иметь конформацию альфа-спирали для всех ак. Поэтому сворачивание начинается не с неопределенности, а с определения стартовой конформации. Пример - бета-галактозидаза. Она еще и четвертичную структуру успевает образовать, сидя на рибосоме. Рибосома упорядочивает процесс, задавая определенную направленность сворачивания вдоль полипептидной цепи – от N-конца к С-концу. Существуют многочисленные, хотя и косвенные, свидетельства того, что полипептидная цепь в процессе своего синтеза может не сразу свешиваться с ПТЦ рибосомы в среду, а попадает сначала в специальный туннель внутри рибосомы (внутри ее большой субъединицы) или в желоб (канал) на поверхности рибосомы и свешивается с рибосомы в окружающую среду лишь на выпуклой, обращенной от малой субъединицы, стороне. Это облегчает образование альфа-спирали, потому что: она наиболее насыщена водородными связями - и наименее липкая для окружения, канал маленький - спираль узкая, это жесткая конформация - легче пропихнуть, это стандартная конформация, рибосома ее стабилизирует. Однако потом было предложено следующее: растущий пептид, выходя из ПТЦ, проходит не через внутририбосомный туннель, а по каналу или желобу на поверхности рибосомы, и в таком случае различные участки на пути полипептида могут оказаться доступными для атаки различных ферментов. Подтверждением идеи поверхностного канала или желоба для растущего полипептида на рибосоме явилось открытие у эукариот цитоплазматического «комплекса, ассоциированного с растущим пептидом» (NAC). свете этого открытия именно NAC, а не рибосома, мог бы быть ответственным за защиту С-концевого участка растущей цепи.

2) провзаимодейстовать с шаперонами и отдать себя в его руки - и тоже свернуться -в соответствии с вышесказанным считается, что основная функция молекулярных шаперонов состоит в поддержании полипептидных цепей в состоянии, компетентном к сворачиванию в глобулу. Показано, что у эукариот растущие полипептидные цепи, связанные с рибосомой, могут быть ассоциированы с двумя белками теплового шока, Hsp70 и Hsp40, известными как молекулярные шапероны.Далее, уже вне рибосомы, некоторые синтезируемые полипептиды могут взаимодействовать с крупными гетеро-олигомерными кольцевыми комплеками, обеспечивающими окончательное сворачивание освободившихся полипептидных цепей; эти белковые структуры обозначаются как шаперонины - TriC у эукариот и GroEL/GroES у прокариот, этот процесс уже энергозависимый.