Шаперони і фолдази, їх роль у фолдингу.

Зрозуміло, що все це неможливо здійснити in vivo - достатньо сказати, що загальна середня концентрація білків у клітині становить ~100 мг/мл або більше. Тобто клітинні умови є дуже агресивними для поліпептидного ланцюга, що перебуває у процесі пошуку своєї нативної конформації, і без спеціальних механізмів більшість білків просто не встигли б після свого синтезу таку конформацію знайти, швидко опинившись у складі агрегату. Такі механізми - створення рівноважних умов поступового пошуку нативної структури та захист від агрегації - забезпечуються спеціальними білками – шаперонами (від фр. Chaperon - капюшон, або особа, що супроводжує незайману дівчину).

Шаперони не визначають ані нативну структуру білка, ані шлях її укладання - і те, й інше детермінується амінокислотною послідовністю. Головна функція шаперонів - забезпечити умови для швидкого пошуку нативної конформації, створюючи своєрідний «інкубатор» для неструктурованого поліпептидного ланцюга.

Серед досить великої кількості шаперонів є специфічні - зокрема такі, що обслуговують процеси збирання мультибілкових комплексів і субодиничних білків. Більш універсальні шаперони відносять до родини hsp - білків теплового шоку (heat shock proteins). Білки hsp є загальним компонентом клітин для всіх таксономічних груп, у пойкілотермних організмів транскрипція на генах hsp активується у відповідь на зростання температури до 30 - 40 °С при гальмуванні транскрипції більшості інших генів(тепловий шок).

Процес згортання пептидного ланцюга в просторову структуру і досягнення білком правильної конфігурації називається фолдигом. Для невеликих білків характерно мимовільне утворення третинної структури, а для фолдингу великих білків необхідні спеціальні допоміжні білки - шаперони і ферменти - фолдази. Фолдинг за участю фолдаз і шаперонів зазвичай призводить поліпептидних ланцюг до «правильної», найбільш оптимальної в енергетичному та функціональному відношеннях, структури.

Шаперони: вони являються білками, основна функція яких залежить у відновленні третинної структури пошкоджених білків, а також утворення та дисоціація білкових комплексів. Температура сильно впливає на холдинг білка. Шаперони здатні синтезувати тільки що утворених білків, коли вони виходять з рибосоми. Фолдази: приймають участь у згортанні поліпептидних ланцюгів. Формування та ізомеризація дисульфідних зв’язків еукаріот.

37. Виділяють такі основні функції біологічних мембран:

1) бар’єрна функція (забезпечує селективний, регульований, пасивний і активний обмін речовин клітини з оточуючим середовищем (селективний – означає вибірковий: одні речовини переносяться через біологічні мембрани, інші – ні; регульований – проникність мембрани для певних речовин змінюється залежно від функціонального стану клітини; активний – перенесення проти градієнту концентрації); завдяки напівпроникності забезпечується селективний транспорт і розподіл іонів між клітиною та середовищем);

2) матрична функція (забезпечує взаємне розташування та орієнтацію мембранних білків, їх оптимальну взаємодію (наприклад, взаємодію мембранних ферментів));

3) механічна функція (забезпечує міцність та автономність клітини і внутрішньоклітинних структур);

4) енергетична функція (забезпечує синтез АТФ на внутрішніх мембранах мітохондрій, фотосинтез вуглеводів у мембранах хлоропластів);

5) генерація та проведення біопотенціалів (включає канали, насоси та обмінники, забезпечує транспорт іонів);

6) рецепторна функція (механічна, акустична, зорова, хімічна, терморецепція);

7) адгезивна (забезпечує міжклітинні взаємодії);

8) рухлива (забезпечує процес руху клітин);

9) секреторна (забезпечує процес екзо- та ендоцитозу) та ін.

Отже, біомембрани відіграють важливу роль як у структурній організації, так і в функціонуванні клітин і клітинних органел. Вони:

 відділяють клітини від оточуючого середовища;

 поділяють клітину на компартменти (відсіки);

 регулюють транспорт речовин до клітини та в органели або зворотному напрямку;

 забезпечують специфіку міжклітинних контактів;

 сприймають, посилюють і передають всередину клітини сигнали із

зовнішнього середовища.

Основні (загальні) принципи структурної організації усіх мембран подібні, однак плазматична мембрана, ендоплазматичний ретикулум, апарат Гольджі, мітохондріальна і ядерна мембрани мають свої суттєві структурні особливості.

Призначення клітинних мембран: 1) механіко-просторова функція; 2)сенсорно-сигнальна; 3) трансформація енергії; 4) захисна.

Розглянемо будову (структурний склад) і властивості біомембран на прикладі мембрани еритроцитів. Еритроцити – традиційна модель для біофізичних досліджень при вивченні структурної і функціональної організації клітинних мембран. У чистому вигляді їх отримати порівняно нескладно, оскільки вони не містять внутрішньоклітинних мембран. Згідно з рідинно- мозаїчною моделлю, еритроцитарні мембрани розглядають як неперервний твердопружний білковий каркас, комірки якого заповнені ліпідним бішаром. Він представляє собою єдину сітку, організовану за рахунок чисельних слабких зв’язків (іонних, водневих, Ван-дер-ваальсових та ін.), які діють як на стиках протомерів, так і всередині них. Цей каркас характеризується високою еластичністю та обумовлює в’язкопружні властивості інтактних мембран як цілого. Білковий каркас разом з ліпідною фазою контролює рухливість мембранних рецепторів і ферментів, а також механічні та морфологічні властивості клітин.

Еритроцитарна мембрана складається з білків (50%), ліпідів (40%) і вуглеводів (10%). Більша частина вуглеводів (93%) зв’язана з білками, інша – з ліпідами. У мембрані еритроцитів ідентифіковано близько 200 різних ліпідів. Ліпіди у мембрані розміщені асиметрично. Ця асиметрія підтримується,__ ймовірно, за рахунок поперечного переміщення фосфоліпідів у мембрані, яке відбувається за допомогою мембранних білків та за рахунок енергії метаболізму. Спонтанне перевертання (фліп-флоп) сфінголіпідів та

фосфогліцеридів у мембрані – процес повільний, утруднений нездатністю полярних голівок проникати через гідрофобний шар. У внутрішньому шар еритроцитарної мембрани знаходиться головним чином фосфатидилінозитол, фосфатидилетаноламін, фосфатидилсерин, а у зовнішньому – фосфатидилхолін.

До складу плазматичної мембрани еритроцитів входить не менше ста різних білків. Найбільш дослідженими з них є такі: спектрин (виконує структурну роль, є периферичним білком, зв’язаним з внутрішньою частиною еритроцитарної мембрани), анкірин (периферичний білок), білок, що утворює аніонний канал, так звані білки смужки 3 (назва походить від рухливості при електрофорезі в поліакриламідному гелі, складається з 900 амінокислотних залишків, ймовірно, бере участь у полегшеній дифузії аніонів гідрокарбонату та іонів хлору через мембрану) та смужки 4.1, глікофорин (інтегральний глікопротеїн, містить 131 амінокислотний залишок), актиноподібні білки. Інтегральними комплексами, які виступають над поверхнею, є глікофорин та білок смужки 3, з ними зв’язаніпідмембранні елементи цитоскелету. Білок смужки 3 зв’язаний у цитозолі з анкірином, який, у свою чергу, зв’язаний зі спектрином. Спектрин міцно асоційований з актиноподібними білками еритроцитарної мембрани, утворюючи подібну до актоміозину АТФ-залежну систему. В цілому, за рахунок структурних білків, які забезпечують форму еритроцита і визначають механічні властивості мембран, формується цитоскелетний каркас, який надає еритроциту характерну двояковвігнуту форму. Дефекти білків цитоскелету лежать в основі їх руйнування при старінні, а також деяких захворювань (серповодноклітинна анемія та ін.). Вуглеводневі компоненти глікофорину виконують рецепторну функцію для вірусів грипу, гемаглютинінів, деяких гормонів.

38. Сучасні моделі. Рідинно-мозаїчна модель. Сукупність результатів,отриманих фізико-хімічними методами досліджень, сприяли появі нової моделі будови біологічних мембран – рідинно-мозаїчної (Сингер і Нікольсон, 1972 р.)(рис. 1.2). Структурну основу біологічної мембрани складає подвійний шар ліпідів (плинний фосфоліпідний бішар, у який занурені білки), інкрустований білками,подібно мозаїці. Розрізняють поверхневі (або периферичні) та інтегральні білки.За фізіологічних умов ліпіди знаходяться у рідкому агрегатному стані. Це дозволяє порівняти мембрану з фосфоліпідним «морем», в якому плавають білкові «айсберги». Рідинно-мозаїчна модель будови мембрани є сьогодні загальноприйнятою. Проте, не всі білки вільно дифундують у рідкому ліпідному бішарі. Деякі ділянки мембран відрізняються за своєю структурою від класичного ліпідного бішару внаслідок ліпідного поліморфізму. В межах однієї мембрани можуть знаходитися ділянки з різним ліпідним складом і функціями. Вважають, що така складна динамічна структура біомембран, для якої характерні викривлення, фазові переходи, різна товщина, утворення небішарових структур, визначається взаємодією мембранних білків з ліпідами.

Рис. 1.2. Модель структурної організації біомембрани за Сингером-Нікольсоном.

Ці взаємодії багато в чому забезпечують ефективне виконання мембранами різноманітних клітинних функцій. Як наслідок, існують різні моделі організації мембрани, які ми розглянемо далі

39. Мембранні білки — молекули білків, що містяться в біологічних мембранамах клітини або її органел або зв'язані з ними. Більш ніж половина всіх білків тим чи іншим чином взаємодіють з мембранами. За топологічним розташоуванням відносно мембрани мембранні білки можуть бути поділені на монототні (на одній стороні) та політопні (на обох сторонах мембрани), за спорсобом зв'язування з мембраною — на інтегральні та периферійні, що дає 3 можливі підгрупи:

• Інтегральні мембранні білки постійно перебувають у мембрані. Для відділення від мембрани вони вимагають детергентів (наприклад SDS або Тритон X-100) або неполярних розчинників. У свою чергу, ці білки класифікаються у дві групи згідно з їхнім розташуванням у ліпідному бішарі:
• Трансмембранні білки проходять крізь всю мембрану. Трансмембранні ділянки білків мають структуру або альфа-спіралей, або бета-барелей. Спіральні трансмембранні білки присутні у всіх видах біологічних мембран, включаючи цитоплазматичну. Тоді як трансмембранні білки у з альфа-спіральною структурою існують у всіх типів клітин, бета-барелі знайдені тільки в зовнішній мембрані грам-негативних бактерій, клітинній стінці грам-позитивних бактерій і зовнішній мембрані мітохондрій і хлоропластів.
• Інтегральні монотопні білки розташовані тільки на одній стороні мембрани.
• Периферійні мембранні білки тимчасово зв'язуються із ліпідним бішаром або з інтегральними мембранними білками за допомогою гідрофобних, електростатичних та інших нековалентних взаємодій. Периферійні білки від'єднуються під дією деяких полярних речовин, наприклад, розчину з високим pH або високими концентраціями солі.

Інтегральні та периферійні білки можуть бути змінені за допомогою посттрансляційної модифікації, зокрема додаванням жирних кислот, фенільних ланцюжків, або GPI(глікофосфоділінозитолу), що допомогоє їм міцніше приєднатися до ліпідного бішару.

Деякі пептидні токсини, такі як колхіцин-A або альфа-гемолізин, та деякі білки, залучені в регулювання апоптозу, одночасно входять до різних категорій цієї класифікації. Ці білки водорозчинні, але вони можуть агрегувати та необоротно зв'язуватися з мембранами, де формують трансмембранні альфа-спіралі або бета-барелі. Часто ці білки називаються амфітрофними.

Мембранні білки: структура та функції. Основна роль ліпідів у складімембран полягає у стабілізації бішарової структури. Як вже зазначалось, білки мембран відрізняються за своїм положенням у мембрані. Мембранні білки, якіконтактують з гідрофобною ділянкою ліпідного бішару, повинні бути амфіфільними, тобто мати неполярний домен. Отже, важливий момент використання методів для досліджень мембранних білків – способи їх прикріплення до мембрани:

1) зв’язування з білками, зануреними у бішар (рис. 6.1).

Як приклад, можна навести F1-частину Н+-АТФази, яка зв’язується з F0- частиною, зануреною у мембрану, білки цитоскелету;

Рис. 6.1. Приклад зв’язування з білками зануреними у бішар [6].

2) зв’язування з поверхнею бішару (рис. 6.2).

Ця взаємодія має електростатичну природу (наприклад, білок мієлину), або гідрофобну (наприклад, деякі поверхневоактивні пептиди). На поверхні деяких мембранних білків є гідрофобні домени, які утворюються завдяки особливостям вторинної або третинної структури. Ці поверхневі взаємодії можуть використовуватися як додаткові до інших взаємодій, наприклад, до трансмембранного заякорювання;

Рис. 6.2. Зв’язування з поверхнею бішару [6].

3) зв’язування за допомогою гідрофобного «якоря» (рис. 6.3).

Рис. 6.3. Прикріплення мембранних білків за допомогою гідрофобного «якоря» [6].

 

 

Ця структура, як правило, є послідовністю неполярних амінокислотних залишків (наприклад, у цитохромі b5). Деякі мембранні білки використовують, як якір, ковалентно зв’язані з ними жирні кислоти або фосфоліпіди;

4) трансмембранні білки (рис. 6.4).

Деякі з них пересікають мембрану лише один раз (наприклад, глікофорин), а інші – кілька разів (наприклад, лактозопермеаза, бактеріородопсин).

Рис. 6.4. Приклади трансмембранного розміщення мембранних білків [6].

Також для визначення методів дослідження білків мембран необхідно враховувати функціональну класифікацію мембранних білків, а саме: 1. ферментативні; 2. транспортні; 3. рецепторні; 4. каналоутворюючі; 5. ворітні; 6. структурні, а також їх класифікацію за локалізацією по відношенню до ліпідів: 1. інтегральні, 2. периферичні, Відмінності між зовнішніми (або периферичними) і внутрішніми (або інтегральними) мембранними білками не задається однозначно способом їх прикріплення до бішару. Вони визначають лише відносну силу їх зв’язування

40. Міжкліти́нні конта́кти — спеціалізовані ділянки поверхні клітини, якими вона кріпиться до інших клітин або позаклітинного матриксу^[1]. До основних функцій міжклітинних контактів належить утримання клітин разом, забезпечення «спілкування» між ними, правильна їх орієнтація одна відносно іншої, регулювання переміщення клітин^[2].

Злипання клітин між собою та приєднання їх до міжклітинного матриксу забезпечують молекули клітинної адгезії: кадгерини, інегрини, білки суперродини імунглобулінів, муцини та селектини. Цитоплазматична частина цих білків зазвичай приєднана до елементів цитоскелету. Більшість CAM рівномірно розподілені по поверхні цитоплазматичної мембрани і їх здебільшого достатньо для утримання клітин разом, проте в деяких тканинах на поверхні клітин формуються спеціалізовані ділянки скупчення молекул адгезії, саме для означення таких ділянок і використовують термін «міжклітинні контакти»

У залежності від того, чи контакти утворюються між однаковими чи різними клітинами, вони поділяються на гомо- та гетерофільні відповідно

На основі структури і функцій клітинні контакти класифікують на чотири основні групи

· Якірні контакти (англ. anchoring junctions) — включають як з'єднання двох клітин, так і з'єднання клітин із позаклітинним матриксом завжди асоційовані з елементами цитоскелету: актиновими або проміжними філаментами. Не зважаючи на те, що якірні контакти мають відмінності у структурі, для них всіх характерна наявність трьох основних елементів: молекули клітинної адгезії (кадгеринів у випадку взаємодії клітина-клітина або інтегринів у випадку взаємодії клітина-позаклітинний матрикс), адаптерного білка, що кріпить CAM до цитоскелету, та пучка актинових або проміжних філаментів

· Адгезивні контакти (англ. adhesive junctions) або зони злипання — з'єднують пучки актинових волокон у сусідніх клітинах. Сполучають латеральні поверхні епітеліальних клітин, навколо яких утворюють пояски, що розташовуються відразу ж під зоною щільних контактів^[3][4].

· Контакти із позаклітинним матриксом, приєднані до актинових філаментів;

· Десмосоми або пластинки прикріплення — з'єднують пучки проміжних філаментів у сусідніх клітинах;

· Гемідесмосоми — контакти клітини із позаклітинним матриксом, схожі за будовою до десмосом.

· Замикальні контакти (англ. occluding junctions) — контакти, що «зшивають» клітини між собою, при цьому їхні мембрани максимально зближуються, внаслідок чого формуються непроникні або вибірково проникні щільні шари.

· Щільні контакти (англ. tight junctions, zonula occludens) — замикальні контакти хребетних тварин;

· Септовані контакти (англ. septate junctions) — замикальні контакти безхребетних тварин.

· Контакти, що формують канали, або комунікативні контакти сполучають цитоплазму сусідніх клітин і допомагають інтегрувати їхній метаболізм:

· Щілинні контакти або нексуси (англ. gap junctions) — комунікативні контакти тварин;

· Плазмодесми — цитоплазматичні містки між рослинними клітинами.

· Контакти, що передають сигнали, беруть участь у передачі інформації між клітинами через мембрани.

· Хімічні синапси;

· Імунологічні синапси;

· Трансмембранні клітинні контакти ліганд-рецептор (наприклад Delta-Notch, ephrin-Eph). Будь-який із трьох інших типів клітинних контактів може виконувати крім структурної сигнальну функцію.

41.. 41.види транспорту молекул та іонів через біологічні мембрани Мембрани регулюють процес транспорту до клітини потрібних речовин та виведення із неї відходів. Розрізняють наступні види клітинного транспорту:

Пасивний транспорт — рух речовин через мембрану за градієнтом концентрації (від ділянки з більшою концентрацією до ділянок із меншою концентрацією) без витрат енергії:

Проста дифузія — рух речовин (наприклад гідрофобних молекул або розчинених газів) безпосередньо через ліпідний бішар. Різновидом простої дифузії є осмос — рух води через напівпроникну мембрану з ділянки з меншою концентрацією розчину до ділянки з більшою концентрацією.

Полегшена дифузія — рух молекул через особливі білкові канали або за посередництва білкових переносників за градієнтом концентрації (наприклад рух неорганічних іонів через іонні канали).

Активний транспорт — рух речовин через мембрану проти градієнту концентрації, що відбувається із витратою енергії та здійснюється за допомогою спеціальних білків-насосів. Розрізняють первинний активний транспорт, для якого використовується енергія гідролізу АТФ, та вторинний активний транспорт, за якого для транспорту однієї речовини проти градієнту концентрації інша транспортується за градієнтом.

Ендоцитоз та екзоцитоз — енерговитратні процеси транспортування речовин і часточок у клітину (ендоцитоз) або з клітини (екзоцитоз) за участі мембранних везикул (пухирців).