Особливості мітохондріальних геномів

Сукупність послідовностей ДНК у гаплоїдному наборі даного організму називається геномом.

Мітохондріальна ДНК людини 16 569 кількість хромосом 1 кількість білкових молекул 37.

Геном мітохондрій і хлоропластів- автономний елемент еукаріотичного геному. Циркулярна (як правило) молекула мітохондріальної ДНК містить від 6 тис. до 2 млн. пар основ і певний набір генів (рРНК, тРНК, деяких білків). Мітохондріальні гени містять інтрони (але не у ссавців). Розмір мітохондріального геному знижується в ході еволюції. Циркулярна ДНК хлоропластів більша за розміром – містить до 200 тис. пар основ, хлоропластний геном кодує до ~100 білків.

У ссавців кожна молекула мтДНК містить 15000-17000 пар основ (у людини 16565 пар нуклеотидів - дослідження закінчено в 1981 році [22], по іншому джерелу 16569 пар [23]) і містить 37 генів - 13 кодують білки, 22 - гени тРНК, 2 - рРНК (по одному гену для 12S і 16S рРНК). Інші багатоклітинні тварини мають схожий набір мітохондріальних генів, хоча деякі гени можуть іноді бути відсутнім. Генний склад мтДНК різних видів рослин, грибів і особливо протистов [24] розрізняється більш значно. Так, у жгутіконосцев-якобіди Reclinomonas americana знайдений найповніший із відомих мітохондріальних геномів: він містить 97 генів, в тому числі 62 гена, що кодують білки (27 рибосомальних білків, 23 білка, що беруть участь в роботі електрон-транспортного ланцюга і в окисного фосфорилювання, а також субодиниці РНК-полімерази).

Один з найбільш маленьких мітохондріальних геномів має малярійний плазмодій (близько 6.000 п.о., містить два гени рРНК і три гени, що кодують білки).Нещодавно відкриті рудиментарні мітохондрії (мітосоми) деяких протистов (дизентерійної амеби, мікроспоридій і лямблій) не містять ДНК.Мітохондріальні геноми різних видів грибів містять від 19 431 (що діляться дріжджі Schizosaccharomyces pombe) до 100 314 (сордаріоміцет Podospora anserina) пар нуклеотидів

Деякі рослини мають величезні молекули мітохондріальної ДНК (до 25 мільйонів пар основ), при цьому містять приблизно ті ж гени і в тій же кількості, що й менші мтДНК. Довжина мітохондріальної ДНК може широко варіювати навіть у рослин одного сімейства. У мітохондріальної ДНК рослин є некодуючі повторювані послідовності.

Геном людини містить тільки по одному промотор на кожну комплементарну ланцюг ДНК

Геном мітохондрій людини кодує наступні білки і РНК:

Белки или РНК

NADH-дегидрогеназа (комплекс I)

Кофермент Q - цитохром c редуктаза /Цитохром b (комплекс III)

цитохром c оксидаза (комплекс IV)

АТФ-синтаза

рРНК

тРНК

Кодони мітохондріального геному мають деякі відміності від тих кодують послідовностей універсальної ядерної ДНК. Так кодон АUA кодує в мітохондріальному геномі метіонін (замість ізолейцину в ядерній ДНК),кодони AGAIAGG-термінаторні кодони (в ядерній ДНК кодують аргінін),кодон UGA в мітохондріальному геномі кодує триптофан.

У людському мітохондріальному геномі інформація настільки сконцентрована, що в послідовностях кодують мРНК,як правило, частково видалені нуклеотиди, відповідні 3' – кінцевим термінатор ним кодонам.

Крім вивчення для побудови різних філогенетичних теорій, вивчення мітохондріального геному – основний інструмент при проведені ідентифікації.Можливість ідентифікації пов'язана з існуючими в мітохондріальному геномі людини груповими і навіть індивідуальними відмінностями.

 

16. РЕПЛИКАЦІЯ ДНК. Репликацией называется процесс удвоения ДНК. Принципиальный механизм репликации вытекает из строения молекулы ДНК.

Процесс репликации состоит из трех стадий: инициации (начало процесса), элонгации (собственно синтез) и терминации (окончание процесса).

Единица, с помощью которой клетка контролирует отдельные акты репликации, получила название репликона. Каждый репликон в каждом клеточном цикле активизируется только один раз. В нем обязательно должны присутствовать необходимые для репликации контролирующие элементы: точка начала (origin), в которой инициируется репликация, точка окончания (terminus), в которой репликация останавливается.

В точке начала репликации начинается разъединение цепей ДНК, формируется репликационный «глазок». Точка, в которой происходит репликация, получила название репликационной вилки (см. Приложение). Репликация может осуществляться либо в одном, либо в двух направлениях. При однонаправленной репликации вдоль ДНК движется одна репликационная вилка. При двунаправленной репликации от точки начала в противоположных направлениях расходятся две репликационные вилки. Каждая хромосома эукариот образована большим колическтвом репликонов, соответственно имеется много точек начала репликации. Это значительно сокращает продолжительность процесса. По мере прохождения репликации «глазки» постепенно расширяются и сливаются друг с другом (см. Приложение).

Инициация. Точки начала репликации на молекуле ДНК имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами А-Т. Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связываются несколько молекул специальных узнающих белков (у прокариот это белки DnaA).

Первым начинает действовать фермент геликаза (от helix - спираль). Он обеспечивет расплетение двойной спирали родительской ДНК путем разрыва водородных связей между нуклеотидами. На это затрачивается энергия гидролиза АТФ – по две молекулы на разделение 1 пары нуклеотидов. У эукариот одновременно происходит вытеснение данного участка ДНК из связи с гистонами и другими хромосомными белками.

Однако расплетение спирали на некотором участке создает суперспирализацию перед этим участком, так как каждая молекула ДНК некоторыми участками зафиксирована на ядерном матриксе. Поэтому она не может свободно вращаться при какого-то своего участка. Это и вызывает суперспирализацию, что препчтствует дальнейшему расплетению цепи.

Эта проблема решается с помощью ферментов топоизомераз. Существует два типа топоизомераз (топоизомераза типа I и топоизомераза типа II). Топоизомераза I разрывает одну из цепей ДНК, и переносит один свободный конец на себя. Это позволяет участку ДНК от места расплетения до места разрыва вращаться вокруг целой цепи, что предупреждает образование супервитков. Впоследствии концы разорванной цепи вновь замыкаются. Топоизомераза II разрывает обе цепи ДНК, перенося соответствующие концы на себя. Это позволяет более эффективно решать проблему суперспирализации при расплетении ДНК.

После расплетения двойной спирали хеликазой, с каждой из двух нитей связываются специальные SSB-белки. Они обладают повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии. Механизм действия основных ферментов репликации ДНК-полимераз таков, что синтез новой полинуклеотидной цепи не может начаться с включения в нее первого нуклеотида. Синтез идет только как удлинение уже существующего полинуклеотида, который комплементарен матрице и образует с ней двуспиральный комплекс матрица-затравка. Во всех живых системах такой затравкой служит не ДНК, а короткая РНК. РНК-затравка синтезируется ферментом праймазой (или РНК-полимеразой).

Элонгация. На этой стадии осуществляется синтез цепей ДНК. Каждый нуклеотид включается в цепь лишь в случае его комплементарности нуклеотиду, занимающему данную позицию в составе матрицы. Ферментный комплекс функционирует так, что одна из двух цепей растет с некоторым опережением по сравнению с другой цепью. Соответственно, первая цепь называется лидирующей, а вторая – запаздывающей. Важнейшее обстоятельство состоит в том, что лидирующая цепь образуется в виде непрерывного очень длинного фрагмента. Запаздывающая цепь образуется в виде серии относительно коротких фрагментов – примерно по 1500 нуклеотидов. Это т.н. фрагменты Оказаки. В виде фрагментов Оказаки синтезируется та цепь, направление образования которой противоположно направлению движения соответствующей репликативной вилки. Рост цепей ДНК осуществляется ферментами ДНК-полимеразами. Удлиннение цепи ДНК (или отдельного ее фрагмента) всегда происходит в направлении от 5’-конца к 3’-концу. Это означает, что очередной новый нуклеотид присоединяется к 3’-концу растущей цепи.

У прокариот известно три ДНК-полимеразы: ДНК-полимераза I, ДНК-полимераза II и ДНК-полимераза III.

ДНК-полимераза III у прокариот является основным ферментом. Он осуществляет синтез лидирующей цепи и фрагментов Оказаки в направлении 5’-3’ от 3’-ОН-затравки. Помимо ДНК-полимеразной активности, ДНК-полимераза III обладает еще одной – 3’-5’-экзонуклеазной. Последняя срабатывает в тех случаях, когда допущена ошибка и в строющуюся цепь включен «неправильный» нуклеотид. Тогда, распознав дефект спаривания оснований, фермент отщепляет с растущего (3’-) конца последний нуклеотид, после чего опять начинает работать как ДНК-полимераза. На лидирующей цепи ДНК-полимераза III движется вслед за хеликазой до конца репликона (или всей молекулы). На запаздывающей цепи ДНК-полимераза III доходит до РНК-затравки предыдущего фрагмента Оказаки и отделяется. На смену ДНК-полимеразе III приходит ДНК-полимераза I. Этот вспомагательный фермент имеет значительно меньший размер и обладает тремя ферментативными активностями. Первая из них – 5’-3’ – экзонуклеазная. За счет этой активности осуществляется последовательное отщепление нуклеотидов с 5’-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента. На освобождающееся место фермент включает дезоксирибонуклеотиды, присоединяя их к 3’-концу «своего» фрагмента (ДНК-полимеразная активность). И, наконец, подобно ДНК-полимеразе III, ДНК-полимераза I может при необходимости корректировать свою работу с помощью 3’-5’ – экзонуклеазной активности. Работа ДНК-полимеразы I завершается, когда растущий фрагмент вплотную доходит до предыдущего фрагмента.

Что касается эукариот, то здесь функциональным аналогом прокариотической ДНК-полимеразы III является, видимо, комплекс α и δ -ДНК-полимераз; при этом корректирующая 3’ - 5’-экзонуклеазная активность присуща δ -ДНК-полимеразе. Функции ДНК-полимеразы I тоже распределены между двумя ферментами: 5’-3’ экзонуклеазная активность (удаление РНК-затравки) осуществляется, вероятно, специальной нуклеазой, а ДНК-полимеразная активность (застраивание брешей) β – ДНК-полимеразой (другой ее функцией является репарация).

Для завершения репликации (терминации) используются ферменты лигаза и теломераза.

В результате действия предыдущих ферментов новосинтезированная запаздывающая цепь оказывается состоящей из фрагментов, вплотную примыкающих друг к другу (кроме кольцевой ДНК). «Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (фермент образует фосфодиэфирную связь). Для осуществления реакции требуется гидролиз АТФ.

ДНК-полимеразная система оставляет недореплицированными 3’-концы материнских цепей ДНК, т.е. новые цепи оказываются укороченными с 5’-концов. В каждой новой цепи фрагмент Оказаки, находящейся у 5’-конца, как и обычно, начинается с короткой РНК-затравки (у 5’-конца лидирующей цепи тоже находится РНК-затравка). РНК-затравки удаляются специальной нуклеазой. Но застроиться дезоксинуклеотидами образующаяся «брешь» не может, поскольку ДНК-полимеразы не способны действовоать «с нуля», а лишь удлиняют 3’-конец уже имеющегося полинуклеотида. Поэтому получается, что новая цепь должна быть короче старой. Эта проблема решается при помощи фермента теломеразы. Теломераза удлинняет не новую, укороченную цепь, а старую, более длинную. К 3’-концу старой (родительской) цепи теломераза последовательно пристраивает несколько сотен повторяющихся последовательнотей. После чего значительно удлинненная старая цепь становиться способной выступать в качестве матрицы для образования еще одного фрагмента Оказаки новой (укороченной) цепи. Таким образом восстанавливается длина теломерного участка. Существуют и другие, альтернативные механизмы удлинения теломер. Теломерные участки необходимы для фиксации хромосом к ядерному матриксу, что важно при мейозе. Кроме того, наличие теломер предохраняет от недорепликации генетически значимые отделы ДНК. Наконец, теломерные отделы ДНК выступают в качестве «часового» устройства, которое отсчитывает количество делений клетки после исчезновения теломеразной активности. Каждое деление приводит к укорочению теломеры на 50-65 н.п. (кроме половых клеток, где активность теломеразы высокая).

Кроме рассмотренного, известен еще один тип репликации ДНК – по типу «катящегося кольца». Так реплицируются кольцевые ДНК некоторых фагов, вирусов, митохондрий, плазмид. При этом способе в одной из цепей исходной ДНК происходит разрыв и освободившейся 5’конец присоединяется к клеточной мембране. На 3’-конце по комплементарной матрице неразорванной цепи начинается синтез дочерней цепи. При этом происходит вращение родительской молекулы, обеспечивающее «сползание» с нее удлиняющейся дочерней цепи. Последняя нарезается на куски, соответствующие по длине исходной молекуле ДНК. Такой способ репликации обусловливает образование многих копий материнской ДНК.

 

 

17. РНК-затравка Олигорибонуклеотид, синтезируемый с участием РНК-полимеразы или ДНК-праймазы: с 5-конца РНК-затравки с участием ДНК-полимеразы III инициируется синтез новой молекулы ДНК (или фрагмента Оказаки), после чего РНК-затравка отщепляется, образующаяся брешь одновременно застраивается ДНК-полимеразой I, а одноцепочечные разрывы репарируются ДНК-лигазой.

 

Затравочна ДНК-залежна РНК-полімераза (РНК-полімераза або праймаза) - утворює невелику РНК-затравку (приблизно 10 нук-леотидів) на одному з розплетених ланцюгів ДНК у напрямку 5' -— 3'. Склад і порядок нуклеотидів у затравці задається ДНК-матрицею, а зшивка їх 3, 5 -фосфодиефірними зв'язками здійснюється РНК-полімеразою. Необхідність синтезу РНК-затравки обумовлена тим, що основний фермент реплікації - ДНК-полімераза - не здатна самостійно почати синтез нової ДНК у напрямку 5 - 3 без затравки; вона може тільки подовжувати новий полінуклеотидний ланцюг.

Для синтеза фрагментов Оказаки необходима РНК-затравка

После открытия фрагментов Оказаки проблема репликации ДНК осложнилась в еще большей степени. Поскольку ДНК-полимераза не способна инициировать новую цепь, оставалось непонятным, каким образом инициируется каждый из фрагментов Оказаки? Неожиданно обнаружилось, что для образования фрагментов Оказаки в клеточных экстрактах необходимо присутствие не только dATP, dGTP, dCTP и dTTP, но также и смеси рибонуклеозид-5-трифосфатов (АТР, GTP, СТР и UTP). Это и другие наблюдения навели на мысль, что для синтеза ДНК каким-то образом необходим синтез РНК.

В конце концов оказалось, что так оно и есть. Для синтеза фрагментов Оказаки в качестве затравок требуются, как выяснилось, короткие отрезки РНК, комплементарные матричной цепи ДНК. Эта РНК образуется в направлении 5-3 из АТР, GTP, СТР и UTP с помощью фермента, называемого примазой. К З-концу этой короткой одноцепочечной РНК-затравки и присоединяются друг за другом дезоксирибонуклеотидные остатки, комплементарные цепи-матрице ДНК.

Обычно РНК-затравка состоит всего лишь из нескольких рибонуклеотидных остатков (рис. 28-11), к которым затем ДНК-полимераза III присоединяет 1000-2000 дезоксирибонуклеотидных остатков, и в результате образуется фрагмент Оказаки. Естественно, нуклеотидная последовательность новосинтезированного фрагмента Оказаки комплементарна нуклеотидной последовательности соответствующего участка цепи-матрицы. После завершения синтеза фрагмента Оказаки РНК-затравка удаляется, нуклеотид за нуклеотидом, с помощью 5 -3 -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I. По мере отщепления рибонуклеотидных мономеров каждый из них замещается на соответствующий дезоксирибонуклеотид в ходе полимеразной реакции, осуществляемой ДНК-по-лимеразой I; при этом в качестве затравки используется 3-конец предыдущего фрагмента Оказаки. Однако ДНК-полимераза I не может совершить последнее ковалентное присоединение фрагмента Оказаки к растущей цепи ДНК; для этого требуется другой фермент.