Иммуногистохимия, иммуноцитохимия (ИГХ)

ИГХ – комплекс методов, позволяющих выявлять (визуализировать) определенные антигены в составе естественного клеточного или тканевого микроокружения в норме и при патологии. ИГХ основана на тИФА, который проводится in situ, т.е. на гистологических срезах (иммуногистохимия) или мазках, цитопрепаратах (иммуноцитохимия). Образующийся нерастворимый окрашенный продукт локализуется в месте экспрессии антигена и учитывается с помощью световой микроскопии.

Постановка ИГХ предусматривает следующие этапы:

· забор материала;

· приготовление гистологических (цитологических) препаратов;

· фиксацию, подготовку антигенов (зависит от природы антигена и антител);

· собственно окрашивание (тИФА: прямой, непрямой, непрямой с усилением сигнала);

· учет: микроскопия, фотографирование, выдача заключения.

ИГХ позволяет существенно улучшить специфичность и чувствительность патоморфологического метода исследования, что весьма актуально для диагностики опухолей (метастазов), их тканевого происхождения, степени дифференцировки и т.д. (рис. 12).

	Гистологический срез опухолевой ткани молочной железы, окрашенный антителами к PCNA – антигену, ассоциированному с клеточной пролиферацией. Антиген локализуется в ядрах клеток   Клетки, экспрессирующие антиген.
	Гистологический срез метастаза меланомы в лимфоузел, окрашенный антителами против антигена S-100. Антиген локализуется в цитоплазме.   Клетки, экспрессирующие антиген
Cell Analysis 1998 Catalogue// Coulter Corporation 1994-1998.

Рисунок 12. Примеры применения иммуногистохимии для диагностики злокачественных опухолей.

 

Помимо онкологии, ИГХ находит применение для диагностики аутоиммунной патологии, некоторых инфекционных заболеваний, фенотипирования клеток крови и костного мозга и научных целей.

Гомогенные методы иммуноферментного анализа

К гомогенным относятся методы, осуществляемые в однофазной системе, и не требующие стадии механического разделения образовавшихся комплексов. Все гомогенные методы относятся к конкурентным и основаны на одновременном взаимодействии с антителами анализируемого и меченого антигенов. После образования в растворе соответствующего иммунохимического комплекса проводят измерение ферментативной активности, которая пропорциональна концентрации свободного или связанного меченого лиганда.

Одним из распространенных методов является EMIT-анализ (enzyme monitored immunoassay technique), основанный на изменении активности ферментной метки в конъюгате фермент-антиген при образовании комплекса с антителами. Обычно взаимодействие приводит к снижению активности вследствие конформационных перестроек в молекуле фермента или стерическом исключении доступа молекулы субстрата к активному центру фермента. Достоинствами гомогенных методов является значительное сокращение времени проведения анализа (несколько минут), недостатками – меньшая чувствительность и возможность влияния состава анализируемого образца на результаты анализа.

 

Люминесцентный иммуноанализ (ЛИА)

ЛИА развивается с 70-х годов, когда была показана возможность использования люминесценции для определения антигенов и антител. В настоящее время к ЛИА относят методы, основанные на применении явления люминесценции для обнаружения продуктов реакции антиген-антитело. При этом меткой может быть какой-либо из компонентов био- или хемолюминесцентной реакции (кофакторы, катализаторы, ферменты, субстраты и т.д.).

Реакции люминесценции относят к окислительно-восстановительным процессам, в ходе которых образуются нестабильные короткоживущие вещества, пребывающие в электронно-возбужденном состоянии. При переходе в основное (стабильное) состояние происходит излучение света в определенном диапазоне, который легко зарегистрировать с помощью фотоумножителей, фотоприемников и других устройств.

Общая схема реакции:

АГ + АТ-Люминофор = АГ-АТ-Люминофор + hν(фотон)

К преимуществам ЛИА относят:

· автономность (нет неоходимости во внешних источниках возбуждения свечения, что значительно упрощает проведение анализа);

· широкий динамический диапазон;

· возможность получения количественных достоверных результатов;

· высокое отношение полезного/фонового сигналов

· высокую чувствительность.

Методы ЛИА делят на биолюминесценцию и хемолюминесценцию

4.1. Биолюминесцентный иммуноанализ: в реакционную систему входят кофакторы (АТФ или NAD), субстрат (люциферин) и фермент (люциферазы светляков или бактерий)).Таким образом, возможны следующие разновидности ИА:

· люминесцентный иммунокофакторный анализ (ЛИКА). В качестве метки используются кофакторы (АТФ, NAD);

· люминесцентный иммуноферментный анализ (ЛИФА) – в качестве метки применяют ферменты: люциферазы или генераторы кофакторов (пируваткиназу или глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу).

В целом, методы биолюминесцентного анализа характеризуются высокой чувствительностью (до 0,5 нМ антигена) и весьма перспективны для разработки высокоэффективных гомогенных методов ИА (хотя существуют и гетерогенные, в т.ч. твердофазные модификации). Среди недостатков – высокая стоимость препаратов ферментов, необходимость устранения кофакторов и примесей из биологических материалов.

4.2. Хемолюминесцентный иммуноанализ: в реакционную систему входят субстрат, окислитель, фермент-катализатор. Таким образом, различают:

· хемолюминесцентный иммуноферментный анализ (ХИФА). В качестве метки используют фермент-катализатор (пероксидаза, микропероксидаза (фрагмент цитохрома С)). В настоящее время наибольшее распространение получил ХИФА с двумя субстратами (люминол+люциферин) и пероксидазой в качестве метки. Чувствительность метода оценивается в 10^{-13 М антигена; время анализа – 30 минут;}

· хемолюминесцентный субстратный анализ (ХИСА). В качестве метки применяют молекулы субстрата (изолюминол, эфиры акридина). Метод обладает высокой чувствительностью (10^{-12 М или до 0,2 пг антигена для изолюминола, до 10-18 М антигена для эфиров акридина).}

· хемолюминесцентный иммуноанализ с использованием переноса энергии рассмотрим на примере э лектрохемолюминисцентного анализа (ЭХИА).

Метод ЭХИА основан на принципах твердофазного иммуноанализа (технология «сэндвича») с применением электрохемолюминесцентной метки. Одна из коммерчески доступных систем – «ORIGEN», США, - основана на применении магнитных микробус, покрытых моноклональными антителами к искомому антигену, и детектирующих антител, коньюгированных с хелатом рутения. Подобные метки обладают малым молекулярным размером, легко присоединяются к белковым реагентам и не нарушают их иммунных, биохимических и агрегатных свойств.

Типичный анализ проводится по следующей схеме: материал, содержащий искомый антиген, смешивается с магнитными микробусами, покрытыми антителами против антигена, и детектирующими антителами, коньюгированными с меткой. После короткой инкубации анализатор перемещает реакционую смесь в специальную камеру, где происходит захват микробус с помощью магнита, их промывка от несвязавшихся реагентов и измерение люминесценции.

Измерительное устройство включает фотометр и электрод с магнитом. Магнит захватывает микробусы, связавшие антиген и специфическую метку, после чего на электрод подается потенциал (1,5 В), который обеспечивает быстрый обмен электронами между субстратом (трипропиламин) и атомами рутения. Это приводит к люминисценции метки, которая измеряется фотометрически. Измерение можно проводить многократно, поскольку испускание фотона регенерирует метку. Кроме того, реакция происходит в турбулентном потоке микробус в камере, что обеспечивает равномерное смешивание реагирующих компонентов и быстрое протекание реакции (в отличие от ИФА или РИФ, где захват антигена происходит на плоскости и имеет пространственные ограничения).

Заявленная чувствительность при определении антигена составляет до 0,2 10^-12Моль антигена, а динамический диапазон линейной области реакции - шесть порядков.

Системы на основе ЭХИА выпускают также фирмы Roche Diagnostics (Elecsys), Organon Teknika (NucliSens), PerkinElmer (QPCR System5000).