Гетерогенные методы иммуноферментного анализа

Гетерогенный ИФА объединяет методы, в которых анализ проводится в двухфазной системе, при этом разделение на фазы может происходить на любой стадии определения (однако первый этап имеет решающее значение). Если на первой стадии антиген или антитело используют в иммобилизованном состоянии и формирование специфического иммунокомплекса проходит на твердой фазе, то метод относится к твердофазным.

Гетерогенный твердофазный ИФА (ELISA = enzyme linked immunosorbent assay) получил наибольшее распространение в медицинской и лабораторной практике. Для его осуществления обычно применяют 96-луночные полистирольные планшеты, так как на полистироле можно легко адсорбировать антитела, а с помощью специальной обработки и различные антигены.

В случае применения ИФА для поиска антигена (рис. 8) диагностическую систему строят по принципу «сэндвича» (двухцентровый ИФА). Это означает, что для захвата искомого антигена и его детекции используют различные антитела к разным неинтерферирующим детерминантам.

 

Рисунок 8. Схема твердофазного ИФА для определения антигена

 

Первые (захватывающие) антитела сорбируют на стенках лунок. Исследуемый материал вносят в лунку, при этом антиген, взаимодействуя с антителами, фиксируется в ней. Лунки тщательно промывают буферным раствором, чтобы удалить не адсорбировавшиеся вещества. Затем вносят вторые (детектирующие) антитела против искомого антигена, меченные ферментом. В качестве фермента-метки обычно используют пероксидазу хрена. После инкубации лунку снова промывают, чтобы удалить несвязавшиеся меченые антитела. На заключительном этапе в лунки вносят хромогенный субстрат (например, орто-фенилендиамин или тетраметилбензидин). Ферментативное расщепление субстрата приводит к образованию окрашенных продуктов реакции.

Таким образом, изменение окраски содержимого лунки будет свидетельствовать о положительном результате реакции. Более того, интенсивность окрашивания характеризует количество антигена (антител) в образце. Измерение окрашивания раствора обычно проводят на ИФА-ридере (планшетном фотометре).

При серодиагностике (рис. 9) используются полистирольные планшеты, на стенках которых заранее с помощью тех или иных методов адсорбируется ("нагружается") антиген. Для предотвращения неспецифического связывания антител с полистиролом оставшаяся свободной поверхность полистирола блокируется (белки молока, бычий сывороточный альбумин).

Рисунок 9. Схема твердофазного ИФА для определения антител

 

Исследуемая сыворотка вносится в лунку планшета. При этом гомологичные антигену антитела прикрепляются к сорбированному антигену. Не прикрепившиеся антитела удаляют промыванием. Затем в лунки вносят антитела против иммуноглобулинов (антител) человека, меченные ферментом (используя антитела против иммуноглобулинов различных классов, можно получить ценную информацию о характере иммунного ответа). Если в исследуемой сыворотке присутствовали искомые антитела, то они на данном этапе выступят в роли антигенов, с которыми прореагируют меченые антитела. Добавление после промывки хромогенного субстрата позволит учесть реакцию по развивающемуся окрашиванию в лунках.

Конкурентный твердофазный ИФА низкомолекулярных антигенов может быть реализован по следующей схеме (рис. 10). К иммобилизованным на носителе антителам добавляют материал, содержащий анализируемый антиген и определенное количество антигена, меченного ферментом. После проведения инкубации носитель отмывают от несвязавшихся свободного и меченого антигена и регистрируют ферментативную активность на носителе, которая обратно пропорциональна концентрации определяемого антигена.

Рисунок 10. Схема конкурентного твердофазного ИФА для определения антигена

Элиспот (ELIspot), ЭС

ЭС – метод определения клеток, секретирующих определенные продукты (цитокины, антитела, медиаторы и др.). ЭС основан на тИФА по принципу «сэндвича», однако специфический продукт, секретируемый клетками, захватывается и определяется в месте секреции. Таким образом удается избежать его разведения в культуральной жидкости, ферментации клеточными протеазами, потребления клетками культуры, связывания с клеточными или растворимыми рецепторами. После удаления культуры захваченный продукт визуализируется вторыми моноклональными антителами к другому эпитопу продукта, меченными ферментом. После добавления субстрата в местах секреции продукта появляется окрашивание (в виде пятен/точек по принципу: одна специфическая клетка-продуцент – одно пятно). Результат выражается в количестве (проценте) клеток-продуцентов. Несмотря на то, что оба метода основаны на тИФА, они имеют существенные отличия (см. табл. 2).

ЭС применяется для определения секреции цитокинов, антител, биоактивных веществ и медиаторов с целью определения функционального состояния иммунных клеток (цитокиновый профиль, поляризация иммунного ответа Th1-Th2-Th3, функция клеток-регуляторов), секреции специфических и общих IgE и др. для диагностики, мониторинга и контроля терапии аллергии, аутоиммунных заболеваний, трансплантационного иммунного ответа, противоопухолевого иммунитета и т.д. Следует отметить, что ЭС к настоящему времени не нашел широкого применения из-за относительной сложности и дороговизны соответствующих тест-систем.

Таблица 2. Отличия тИФА и Элиспот

	Элиспот	тИФА
Результат	Количество (процент) клеток, секретирующих определенный продукт (например, цитокин)	Концентрация продукта (например, цитокина) на мл супернатанта
Принцип определения продукта:	тИФА, «сэндвич»	тИФА, «сэндвич»
Первые антитела:	Культуральный планшет покрыт антителами до начала культивирования	Определение проводят после культивирования
Вторые антитела:	Добавляются после окончания культивирования	То же
Метод выявления:	Изменение субстрата с образованием цветного продукта непосредственно в культуральном планшете	Изменение субстрата с образованием цветного продукта в планшете для тИФА
Учет:	После высушивания	Фотометрия окрашенной жидкости
Аппарат для учета:	Элиспот ридер/визуальный подсчет пятен	ИФА ридер (возможен визуальный учет)
Количественный результат:	1 пятно = 1 положительная клетка	Измерение оптической плотности, построение калибровочной кривой, расчет количества продукта
Возможность хранения планшета для последующего анализа:	Да (месяцы)	Нет (часы)

Иммуноблот ИБ (вестернблот)

ИБ – метод, позволяющий одновременно выявлять специфические антитела к спектру антигенов (к каждому из них) в сыворотке или другом материале. ИБ основан на тИФА; в отличие от тИФА в планшетах обладает большей специфичностью (но меньшей чувствительностью).

Этапы постановки ИБ (рис. 11):

1. Подготовка антигенов:

· лизис/дезинтеграция вирусов, бактерий;

· обработка додецил сульфатом натрия (SDS) для придания всем компонентам схожего соотношения отрицательный заряд/молекулярная масса.

2. Получение блотов:

· разгонка антигенов в электрофорезе (пропорционально размеру);

· перенос антигенов на мембрану;

· разрезание мембраны на блоты (полоски, содержащие спектр антигенов).

3. Проведение реакции:

· обработка блота сывороткой больного (специфические антитела больного связываются с соответствующими антигенами);

· выявление связавшихся антител антивидовыми антителами к иммуноглобулинам человека, меченными ферментом;

· внесение субстрата и проявление блотов (при связывании специфических антител в месте связывания образуется пятно);

· учет реакции (сравнение результата с положительным и отрицательным контролями) и выдача заключения.

ИБ применяют для:

· подтверждения результатов других серологических реакций;

· идентификации бактериальных или вирусных белков;

· идентификации микробов;

· научных целей.

 

Электрофорез Загрузка в гель Обработка SDS Дезинтеграция микробов
Антигены распределяются в геле в соответствии с молекулярной массой
	· Внесение сыворотки больного (специфические антитела связываются с соответствующими антигенами) · Добавление антител против иммуноглобулинов человека, меченных ферментом · Добавление субстрата и учет реакции

Рисунок 11. Схема проведения иммуноблоттинга