Некоторые перспективные технологии иммуноанализа

Иммуносенсоры (ИС)

ИС – это устройства, состоящие из специфического антигена/ антитела (датчик), связанного с преобразователем и передатчиком сигнала о связывании соответствующего лиганда (рис.13).

 

	Широкий спектр веществ
Специфические (рекомбинантные) антигены / моноклональные антитела
Выделяют четыре типа передатчиков: · измерители электрохимических процессов (потенциометрия, амперометрия); · измерители массы (пьезоэффект); · измерители тепла (колориметрия); · измерители оптических свойств
Количественный результат может быть получен в режиме реального времени

Рисунок 13. Блок-схема работы иммуносенсоров

 

Непрямые ИС – основаны на использовании меченых компонентов для обнаружения связывания (флуоресценция, хемолюминесценция).

Прямые ИС обнаруживают связывание по переносу электронов, выделению или поглощению газов, разности потенциалов, сопротивления, массы, температуры или изменению оптических свойств и т.д. Прямые ИС можно применять для отслеживания реакции антиген – антитело в режиме реального времени.

Потенциально данный подход позволяет определять широкий спектр веществ в концентрации от 10^-9 – 10^-13 М/л и выше.

Основные преимущества ИС:

· отсутствие необходимости в применении меченых лигандов;

· возможность многократного использования;

· возможность мониторирования (получения результатов в реальном времени); высокая чувствительность и специфичность

· технологичность и возможность массового производства.

В настоящее время ИС считаются перспективным направлением иммуноанализа, однако на практике существует весьма ограниченное количество коммерческих тест-систем.

 

Микроэррей (МЭ)

МЭ (microarrey) является сравнительно новым (разработан в 1990-х годах) и весьма перспективным направлением в прикладной молекулярной биологии. В настоящее время наибольшее распространение получила технология микроэррея, основанная на ДНК-олигонуклеотидах, однако развивается и микроэррей с применением моноклональных антител и рекомбинантных антигенов. В частности, подобная технология применяется для диагностики и оптимизации лечения аллергий (рис. 14).

Рисунок 14. Схема проведения микроэрея для диагностики аллергии.

 

1. Приготовление микрочипа: раскапывание рекомбинантных аллергенов на поверхность активированного предметного стекла (объем капли - нанолитры, количество антигена - десятки пикограмм). Одно стекло содержит 12 ячеек. Каждая ячейка содержит десятки (сотни) различных аллергенов и калибровочную кривую (возрастающие количества IgE) в триплетах. Таким образом, одновременно можно обследовать до 12 пациентов.

2-3. Ход теста:

· раскапывание сывороток пациентов (15 мкл);

· инкубация (IgE пациента соединяются с аллергенами)

· добавление моноклональных антител против IgE, меченных флуорохромом;

· сканирование микрочипа:

· типичная сканограмма микрочипа:

· первые три ряда = калибровочная кривая (интенсивность свечения пропорциональна количеству фиксированных IgE);

· далее профиль сенсибилизации пациента (специфичность и количество IgE в сыворотке пациента).

 

Аналогичные микроэрреи применяются для обнаружения и исследования аутоантител против различных компонентов (антигенов) соединительной ткани при системных аутоиммунных заболеваниях (ревматоидный артрит, системная красная волчанка и др.).

Обратная техника (фиксация набора моноклональных антител на стекле) используется для анализа белков, полисахаридов, биологически активных соединений, медикаментов, токсинов и др. в составе клинических образцов, причем можно анализировать не только растворы, но и суспензии клеток (точная диагностика (фенотипирование) лейкозов).

 

Иммунохроматографический анализ (ИХА)

ИХА (предложен в начале 1980-х гг.) можно отнести к группе реакций с мечеными антителами. В качестве метки используют окрашенный латекс или частицы коллоидного золота.

Типичный тест представляет собой пластиковую пластинку и содержит окно для внесения материала, окно для учета результата и одно или несколько окон для внутреннего контроля/контролей (рис. 15).

В реакции используют:

· первые антитела к искомому антигену, иммобилизованные в виде полосы на хроматографическом носителе в окне для учета результата (выше окна для внесения материала);

· вторые антитела к тому же антигену, адсорбированные на микрочастицах золота или латекса (размещаются в окне для внесения материала).

Внутренний контроль/контроли включают:

· выявляемый антиген, нанесенный после окна для учета результата (положительный контроль, контроль протекания всех этапов основной реакции);

· антивидовые антитела против вторых (меченых) антител, закрепленные в виде полосы на носителе (отрицательный контроль, контроль переноса ингредиентов по носителю, адекватность внесения материала);

· неспецифические первые антитела (того же происхождения) (контроль специфичности связывания вторых антител).

Постановка теста на примере системы для диагностики инфекционного мононуклеоза (рис. 16):

Подготовленный исследуемый материал в небольшом количестве (5-7 капель) вносится в стартовое окно тест-системы. Здесь происходит взаимодействие антигена с антителами, адсорбированными на частицах, и начинается движение образовавшихся комплексов за счет капиллярности носителя. Дойдя до антител, расположенных на носителе в окне учета результата, эти комплексы связываются, при этом частицы латекса или коллоидного золота проявляются в виде линии голубого (латекс) или (коричневого) цвета. Поскольку частицы, нагруженные, антителами берутся в избытке, часть их движется дальше и связывается в окне (окнах) внутреннего контроля реакции. Полоса в этом окне свидетельствует о правильной работе тест-системы.

Забор материала	Внесение материала	Учет результата через 5 минут
Рисунок 16. ИХА система для диагностики инфекционного мононуклеоза

 

В настоящее время разработаны тест-системы для установления овуляции и беременности, выявления стрептококков группы А в мазках из зева, вирусов грипа А и В и РС-вируса в соскобах и смывах из носоглотки, возбудителей туберкулеза в мокроте, хламидий в соскобах из уретры и шейки матки, токсина C.dificile в испражнениях, вируса Эпштейн-Барр в крови, определения маркеров повреждения миокарда (инфаркт миокарда), патологического свертывания крови (тромбоз), нарушения обмена кальция (остеопороз) и др.

ИХА может использоваться как для экспресс-индикации антигенов в пробе, так и для идентификации выделенных культур. Например, ИХА позволяет проводить обнаружение листерий в исследуемом материале непосредственно в среде обогащения, без выделения чистой культуры. Это позволяет сократить время исследования до 48 часов.

Таким образом, ИХА тест-системы обладают несомненными достоинствами:

· высокой специфичностью,

· скоростью получения результата,

· доступны, легко интерпретируются,

· не требуют медицинской или лабораторной квалификации,

· могут применяться пациентами самостоятельно в любых условиях.

Однако по чувствительности ИХА системы уступают другим методам иммуноанализа, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста. Существует также проблема документирования результатов и ряд этических проблем, связанных с самостоятельным применением тестов пациентами.

 

Список литературы

Антитела. Методы. В 2-х кн. Кн. 2: Пер. с англ./Под ред. Д.Кэтти. – М.: Мир, 1991. – 384 с.

Иммуноферментный анализ: Пер. с англ./Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа.- М.: Мир, 1988. – 446 с.

Манолов А. Твердофазные радиоиммунные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии //ЖМЭИ, 1985, N:4, с.100-107.

Теория и практика иммуноферментного анализа/ А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова – М.: Высш. шк., 1991. – 288 с.

Тертон М., Бангхем Д.Р., Колкотт К.А. и др. Новые методы иммуноанализа: Пер с англ. – М.: Мир, 1991. – 280 с.

Birjis Chinoy, Edgar Yee, Sami L Bahna Skin testing versus radioallergosorbent testing for indoor allergens//Clinical and Molecular Allergy2005, 3:4.

C. Harwanegg, R. Hiller Protein microarrays for the diagnosis of allergic diseases: State-of-the-art and future development// J Lab Med 2005, 29(4): 272–277.

C. L. Morgan, D. J. Newman, C. P. Price Immunosensors: technology and opportunities in laboratory medicine//Clinical Chemistry 1996,42:2.- P.193-209.

Clinical chemistry, 1990,36/8, 1408-1427.

Immunoassay of infectious agents/ P. E. Andreotti, G. V. Ludwig, A. H. Peruski //BioTechniques 2003,35: P. 850-859.

J. P. GoslIng A Decade of Development in Immunoassay Methodology// Clinical Chemistry, 1990, Vol.36, No. 8, P. 1408.

L. J. Kricka Miniaturization of analytical systems//Clinical Chemistry, 1998,44:9, P. 2008–2014.

L. J. Kricka Selected Strategies for Improving Sensitivity and Reliability of Immunoassays//Clinical chemistry, 1994, 40/3, P. 347-357.

Immunochemical staining methods / S.J.Naish, T.Boenisch, A.J.Farmilo, R.H.Stead//DAKO Corporation, Carpinteria, California, 1989. – P.41.

Methods of Biomaterials Testing // http:\\www.manfred.maitz-online.de

Microarrayed recombinant allergens for diagnostics of allergy/Harwanegg C., Laffer S., Hiller R et al. //Clin. Exp. Allergy 2003, 33: 7- 13.

R Spiewak ELISpot: Principles of the technique//www.ELISpot.biz

R. P. Ekins Ligand assays: from electrophoresis to miniaturized microarrays//Clinical Chemistry, 1998; 44: 2015-2030.

Radioallergosorbent Test (RAST) Methods for Allergen-Specific Immunoglobulin E (IgE) 510(k)s; Final Guidance for Industry and FDA / U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration;Center for Devices and Radiological Health.- August 22, 2001.

Radioimmunometric Assay for a Monoclonal Antibody-Defined Tumor Marker, CA 19-9/ Villano B. C., Brennan S., Bucher C. et al.// Clinical Chemistry,1983, Vol. 29, No. 3, 1983 549-552.

http://biotech.city.tomsk.net/assay/assay.htm – сайт Томского медицинского университета

 

Оглавление

Введение
1. Методы иммуноанализа с применением радиоактивной метки
1.1. Радиоиммунный анализ (РИА)
1.2. Иммунорадиометрический анализ (ИРМА)
2. Методы иммуноанализа с применением флуоресцентной метки
2.1. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)
2.2. Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением (ФИА ВР)
2.3. Проточная цитофлуориметрия
3. Методы иммуноанализа с применением ферментной метки
3.1. Иммуноферментный анализ (ИФА)
3.1.1. Гетерогенные методы иммуноферментного анализа
Гетерогенный твердофазный ИФА (ELISA)
Элиспот (ЭС, ELIspot)
Иммуноблот (ИБ, вестернблот)
Иммуногистохимия, иммуноцитохимия (ИГХ)
3.1.2. Гомогенные методы иммуноферментного анализа
4. Люминесцентный иммуноанализ (ЛИА)
4.1. Биолюминесцентный иммуноанализ
4.2. Хемолюминесцентный иммуноанализ
5. Некоторые перспективные технологии иммуноанализа
5.1. Иммуносенсоры (ИС)
5.2. Микроэррей (МЭ)
5.3. Иммунохроматографический анализ (ИХА)
Список литературы

 

 

Учебное издание

 

 

Черношей Дмитрий Александрович, Канашкова Татьяна Александровна