II. Техника микрокопирования.

1. Поставить микроскоп в удобное для наблюдения положение у края стола. Тетрадь положить справа.

2. Установить микроскоп на малое увеличение (объектив 8^х, или 10^х), доведя револьвер строго до защелки. Затем с помощью поворотов вогнутого зеркала получить равномерное освещение всего поля зрения микроскопа (предпочтительнее пользоваться искусствен­ным освещением от матового светильника).

3. Положить препарат на предметный столик микроскопа так, чтобы
объект находился над отверстием столика покровным стеклом
вверх.

4. Движением кремальеры найти фокус малого увеличения и изучить
препарат. При необходимости рассмотреть какую-либо структуру с
большим увеличением следует поставить ее в центр поля зрения
(передвигая препарат рукой).

5. Затем плавным движением перевести револьвер на большое увели­чение, осторожно с помощью кремальеры установить фокус силь­ного увеличения (обычно нужно слегка приподнять тубус!) и только после этого микрометрическим винтом отфокусировать объект. Работая с большим увеличением, необходимо постоянно
слегка вращать микровинт в обе стороны, т.к. структуры находятся
на различном уровне препарата. Для полученияболее контрастно­
го изображения можно пользоваться конденсором. Кроме того, старайтесь научиться микроскопировать обоими гла­зами, т.к., закрывание одного глаза приводит к быстрому утомле­нию другого.

6. Изучив препарат, приступите к зарисовке. По окончании ее переве­дите микроскоп на малое увеличение и извлеките препарат.

7. Для изучения очень мелких гистологических структур используют иммерсионный объектив (X 90). При этом на покровное стекло препарата наносят каплю иммерсионного масла (кедровое масло), после чего осторожно опускают тубус до прикосновения фронтальной линзы объектива к маслу. Используя микровинт, достигают четкого изображения. После окончания pa­ масло удаляют с объектива и покровного стекла марлей.

При работе с микроскопом нельзя:

1. Вращать микровинт на малом увеличении и за пределы упора ограничителя.

2. Располагать препарат покровным стеклом вниз.

3. Пользоваться загрязненными препаратами, окулярами и другими оптическими частями.

4. Переводить микроскоп на большое увеличение, не добившись резкого изображения на малом.

5. Вынимать препараты из под объектива большого увеличения.

6. Работать при слабом или неправильном освещении объекта.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ГИСТОЛОГИИ, ЦИТОЛОГИИ И ЭМБРИОЛОГИИ.

I.Цито- и гистохимические методы исследования

Цито- и гистохимические методы позволяют выявлять химические соединения различных классов в структурах клеток и тканей, а также их локализацию. Специфичность химической реакции в ряде случаев может быть проверена с помощью дополнительного контроля (например, путем предварительного расщепления соответствующим ферментом).

В основу цито- и гистохимических методов исследования положен ряд принципов.

1. Избирательное окрашивание, при котором определенные химические группировки внутриклеточного вещества вступают в реакцию с красителем.

2. Избирательное растворение красителя в определенном субстрате, характеризующем клеточную структуру.

3. Перевод некоторых неактивных химических соединений, неспособных взаимодействовать с красителем, в активное состояние.

4. Получение с помощью промежуточных реакций неокрашенного продукта с последующим переводом его в окрашенный.

Так, специфичной для выявления ДНК является реакция Фельгена, которая основана на том, что альдегидные группы дезоксирибозы восстанавливают окраску основного фуксина, предварительно обесцвеченного сернистой кислотой (реактив Шиффа). В результате реакции хроматин окрашивается в пурпурно-красный цвет. Для одновременного выявления ДНК и РНК часто применяют метод Браше с использованием метилового зеленого и пиронина. При этом способе метиловый зеленый окрашивает ДНК хромосом в зеленый цвет, а пиронин окрашивает РНК ядрышек и цитоплазмы в красный цвет.

Выявление гликогена, гликопротеинов, гликолипидов — соединений, содержащих сахара, основано на окислении гликолевых групп последних до альдегидов с последующим взаимодействием с реактивом Шиффа. Продукт реакции окрашивается в различные оттенки пурпурно-красного цвета. В случае выявления гликозаминогликанов (гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, кератансульфат, гепарансульфат, гепарин) используют способность их анионных групп связываться при низких значениях рН с основными красителями или давать метахроматическое окрашивание с тиазиновыми красителями — толуидиновым синим, азуром.

Выявление липидов основывается на их способности окрашиваться растворенными в них красителями, например Суданом.

Сочетание цито- и гистохимических методов исследования с методом электронной микроскопии послужило основой развития электронной гистохимии.

II. Электронная микроскопия

Многие структуры клетки находятся за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Длина волны видимой части спектра лежит в пределах от 0,4 до 0,7 мкм, максимальное разрешение, полученное при этом с помощью светового микроскопа, может составлять 0,2 мкм. Открытие волновых свойств, присущих электронам, послужило основой для создания нового класса приборов — электронных микроскопов.

Максимальное разрешение, которое может быть получено в них при специальных условиях, составляет 0,2 нм, а увеличение может достигать 100— 200 тыс. раз.

Принципы работы электронного микроскопа

Принципиальная схема построения изображения в световом и электронном микроскопах сходна. Однако существует ряд отличий: в электронных микроскопах источником электронов служит катод, входящий в состав электронной пушки, в качестве линз используются электромагнитные катушки. В связи с тем, что в воздухе электроны могут проникать на незначительные расстояния, а затем их скорость гаснет, в электронном микроскопе с помощью специальных насосов создается высокий вакуум (10~4 мм рт. ст.).

В колонне микроскопа (тубусе), из которой откачан воздух, последовательно расположены катод (вольфрамовая нить), анод (металлическая пластинка с отверстием посередине), магнитные линзы, люминесцентный экран, фотопластинки ("магазин").

Ток, проходя через вольфрамовую нить катода, нагревает ее и вызывает эмиссию электронов. Поданное на катод высокое напряжение создает большую разность потенциалов между катодом и анодом, что обеспечивает движение электронов к аноду и далее вниз по колонне микроскопа. Электронный пучок сначала фокусируется первой магнитной линзой — конденсорной. Большая часть электронов, проходя через объект, не отклоняется. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются второй магнитной линзой — объективной, которая дает увеличенное изображение объекта. Это изображение снова увеличивается третьей магнитной линзой—проекционной.

При этом электроны, которые проходят через объект, вызывают свечение экрана, покрытого люминофором, а отклонившиеся электроны не доходят до экрана и не вызывают свечения. Изображение, полученное на люминесцентном экране, можно сфотографировать, если поднять экран, под которым расположен фотомагазин с фотопластинками, чтобы пучок электронов попал на фотопластинку.

II A. Подготовка материала для электронно-микроскопического исследования

Подготовка к электронно-микроскопическому исследованию включает в себя те же этапы, что и при светооптической микроскопии, но с рядом особенностей.

Взятие материала необходимо проводить как можно быстрее, небольшими объемами (не более 1 мм3).

Фиксацию осуществляют, как правило, глутаральдегидом, хорошо стабилизирующим белки, с последующей дофиксацией в тетраоксиде осмия, который стабилизирует фосфолипиды, на холоде в течение нескольких часов. После фиксации материал промывают буферным раствором, обезвоживают спиртами возрастающей концентрации.

Уплотнение и заливку производят с помощью полимеризующейся смеси (эпоксидные смеси). Для этого образцы материала кладут в формы, заливают эпоксидной смолой и помещают в термостат, где происходит полимеризация смолы.

Для приготовления срезов (толщиной 30—50 нм) используют ультратомы, в которых подача блока с объектом на неподвижный нож осуществляется с помощью теплового расширения несущего стержня. В качестве ножей применяют специально приготовленные сколы стекла или алмазов. Получаемые при этом последовательные серийные срезы сползают с ножа в виде лент на поверхность жидкости в прикрепленной к ножу ванночке, откуда их надо перенести на сеточки.

Контрастирование (или окрашивание) срезов проводят с помощью солей тяжелых металлов (свинца, вольфрама, урана). Содержащиеся в этих соединениях элементы с высокой атомной массой осаждаются на фосфолипидах клеточных мембран и не пропускают электронный луч, вследствие чего эти участки клетки выглядят на экране более темными, контрастными по сравнению с другими участками, не содержащими фосфолипидов.

Для ориентировки в изучаемом объекте используют метод изготовления полутонких срезов (1—2 мкм) с последующим окрашиванием (метиленовым синим или толуидиновым синим). Окрашенный срез рассматривают с помощью микроскопа для определения области, которая должна быть изучена на ультрамикроскопическом уровне, и в дальнейшем с этого участка прицельно готовят ультратонкие срезы.