А) определение титра лизоцима классическим методом

Приложение  2

а) ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ЛИЗОЦИМА КЛАССИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

По лизису индикаторной культуры чувствительного микрококка M. lysodeikticus

Ингредиенты

Разведения сыворотки, слюны

 

1:10

1:20

1:40

1:80

1:160

1:320

1:640

К. к.

Физиологический 0,85% раствор поваренной соли

 

 

 

 

 

 

 

 

Субстрат (сыворотка) испытуемый

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

до 1 % р-р

 

Тест-культура микрококка (1 млрд мт в 1 мл) в каплях

2 к.

 

2 к.

 

2 к.

 

2 к.

 

2 к.

 

2 к.

 

2 к.

 

2 к.

Инкубировать 3 часа при +37С°

Учет результатов

Лизис тест-культуры

  Отсутствие лизиса

 

Титр лизоцима в исследуемом субстрате равен 1:40 (максимальное разведение, или минимальное количество, давшее лизис культуры и просветление).  

б) ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА ЛИЗОЦИМА МИКРОМЕТОДОМ

по Н.С. Мотавкиной, Б.М. Ковалеву, А.С. Шаронову (1979)

 В камеру, состоящую из 2 фотопластин и ограничивающей прокладки между ними, внести смесь расплавленной и остуженной до +45С° 2% агарозы и культуры микрококка в концентрации 500 тыс. мт/мл. После застывания агарового субстрата, верхнюю пластинку снимают скользящим движением и с помощью пробойника делают лунки, вносят в одну из них испытуемое вещество, в другую - раствор кристаллического лизоцима. Последний служит контролем и вносится в разных концентрациях в равных объемах. Инкубировать 3 часа при +37С° во влажной камере.

По лизису тест-микроба в присутствии кристаллического лизоцима в контроле строится график зависимости диаметра зоны лизиса от концентрации этого вещества. Диаметр лизиса опытных проб сопоставляют с показателями графика и определяют в них активность (титр) лизоцима.

Приложение 3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТИТРА КОМПЛЕМЕНТА ПО 100% ГЕМОЛИЗУ

ГЕМОСИСТЕМЫ

Приготовить гемосистему:

а) приготовить 3% взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе;

б) гемолитическую сыворотку развести до рабочего титра, указанного на этикетке;

в) приготовить гемолитическую систему, смешав равные объемы 3% взвеси эритроцитов барана и гемолитической сыворотки;

г) инкубировать при +37С° 30 минут;

д) определение титра комплемента осуществить по схеме:

 

Ингредиенты

 

 

Номера пробирок и их содержимого

К

Сыворотка крови больного 1:10 в мл

 

0,1

 

0,15

 

0,2

 

0,25

 

0,3

 

0,35

 

0,4

 

0,45

 

0,5

 

-

 

Физиологический раствор 0,85% в мл

 

0,4

 

0,35

 

0,3

 

0,25

 

0,2

 

0,15

 

0,1

 

0,05

 

-

 

0,5

 

Гемолитическая система в мл

1,0

 

1,0

 

1,0

 

1,0

 

1,0

 

1,0

 

1,0

 

1,0

 

1,0

 

1,0

 

Инкубировать при +37 С° 30-40 минут

Учет результатов

Отсутствие гемолиза

Гемолиз

Нет гемолиза

 

Титр комплемента - 0,3 мл (минимальное количество, дающее гемолиз гемосистемы).

Это количество можно представить в гемолитических единицах.

Пример: Расчет в гемолитических единицах

 0,2 мл - 1 гем.ед.

1,0 мл – х

С учетом разведения сыворотки 1: 10 титр комплемента в гемолитических единицах будет равен: 5 х 10 = 50 гем. ед.