Лабораторные методы поиска продуцентов антибиотиков.

Выделение продуцентов антибиотиков. Методы идентификации продуцентов антибиотиков. Первичная оценка антибиотиков.

Выделение продуцентов антибиотиков ведут из различных источников: грунт, вода, воздух, гнойное выделение и так далее. Но прежде необходимо четко определиться с задачей: мы хотим выделить продуцент известного антибиотика, который хорошо описан, но более эффективный, или принципиально новый продуцент антибиотика, который активен в отношении определенной группы микроорганизмов и принципиально новый антибиотик.

В первом случае: из большого количества выделяемых микроорганизмов будут исследоваться только те микроорганизмы, которые продуцируют данный антибиотик. Так как каждый антибиотик образуется одним ли несколькими определенными организмами, так как каждый организм образует один или несколько конкретных антибиотиков, свойства которых генетически закреплены геномом данного микроорганизма, например, продуцент пенициллина – ограничивается в представителях гриба p. Penicillum, грамицидана – Bacillus.

Во втором случае: принципиально новый продуцент и антибиотик, на предмет антибиотикообразования исследуется каждый микроорганизм.

 

Методы выделения микробов-антагонистов

Существует большое количество методов определения микробов-антагонистов. В первую очередь – правильно подобрать среду для выращивания микробов-антагонистов. Если мы ищем антагонистов среди актиномицетов, то используют среды Гаузе или Чапека, рН 6.8-7.1 после стерилизации, температура культивирования характерна для почвенных микроорганизмов – 27⁰С. Есть термофильные актиномицеты – 55-60⁰С. Среди актиномицетов есть ацидофильные, рН 3.5-6.5 – противогрибные антибиотики как правило. Также встречаются галофильные – растут в среде до 10% NaCl.

Бактерии: подавляющее большинство истинных бактерий растут богатые питательные среды – сусло-агар, МПА, рН 7, а температура определяется в зависимости от места выделения (почва, вода – 27-30⁰С, клинические изоляты – 37⁰С).

При изучении продукции антибиотиков очень важно понять, что среда, которая обеспечивает рост микроорганизмов-продуцентов, не всегда обеспечивает синтез антибиотика (в большей степени). Наиболее богата продуцентами почва.

Методы выделения:

1. Высев почвенной взвеси в воде на поверхность агаровой пластинки.

Навеска почвы растирается в пыль и переносится в колбу со стерильной водой. Взвесь встряхивают и из водной суспензии проводят ряд последовательных разведений, которые высеваются на чашку Петри с соответствующей средой. Полученные колонии переносят в пробирки для последующего изучения.

2. Высев почвы на питательный агар, засеянный тест-культурой. Газоном выращивают культуру – переливают суспензию, среда должна быть разлита ровным слоем, агар застывает ровным слоем, несколько минут после посева газоном, пропитается, не проращивая культуру вносят маленькие кусочки почвы, ставят в термостат, вокруг – зона задержки роста, где антагонисты.

Отбираем этот кусочек почвы, переносим в небольшой объем воды и выделяем чистые культуры, которые исследуются на антагонистическую активность.

3. Метод центрифугирования почвенной суспензии. Обычно используется для разделения спор актиномицетов от бактерий. 3000 об\мин. в течении 20 минут, оседают клетки бактерий и споры грибов, а споры актиномицетов остаются в супернатанте и высевают надосадочную жидкость. Можно получить культуру актиномицетов.

4. Использование питательной среды, содержащей антибиотик. Если мы ищем среди грибов, используют антибиотики, подавляющие бактерии, убираем грибы, актиномицеты – в среду антибиотик подавляет развитие бактерий и грибов и наоборот.