Определение активности антибиотиков

Величины биологической активности антибиотиков обычно выражают в условных единицах, которые содержатся в 1 мл раствора или в 1 мг препарата. Если имеется антибиотик, полученный в чистом виде, то его активность выражают в мкг\мг препарата или мкг\мл препарата.

За единицу антибиотической активности принимают минимальное количество антибиотика, которое способно подавить развитие или задерживать рост определенного числа тест-микроба (стандартного штамма) в единице объема питательной среды. За единицу активности пенициллина принимают минимальное количество антибиотика, которое способно задерживать рост St.aureus 209 в 50 мл бульона. Для стрептомицина за единицу активности принимают минимальное количество антибиотика, который задерживает рост E.coli К12 в 1 мл бульона.

 

Количественное определение антибиотика в культуральной жидкости или в других растворах осуществляется несколькими методами: биологическими, химическими и физико-химическими.

Наиболее распространенным, удобным и достаточно точным является биологический метод. Его можно применять к любым антибиотикам. В основу положен метод серийных разведений. Берут стерильный бульон, который мерно разливается в пробирки, в этом бульоне делается последовательно серийное разведение антибиотика (на уровне культуральной жидкости или раствора) с различным шагом – 2х, 10х, 100х. После этого вносится тест-культура в определенном количестве и инкубируют. На следующий день определяют единицы активности по тому максимальному разведению, которое задерживает рост тест-культуры, и это разведение принимают за единицы активности данного антибиотика. Более точный метод определения при большом шаге разведения: средняя концентрация между последним минусом и первым плюсом (минус – отсутствие роста, плюс – наличие роста). Методом серийных разведений можно определять активность антибиотика и в весовых единицах – мкг\мл. Но это только в том случае, если мы точно знаем, какой антибиотик мы изучаем. Делается тоже ряд разведений (опытного и стандартного антибиотика, который берется в определенной известной концентрации) с последующим посевом, через некоторое время отмечается то максимальное разведение, которое дает задержку роста, и концентрацию антибиотика определяют по отношению разведения испытуемого раствора к разведению стандартного антибиотика, и умножают на концентрацию стандартного антибиотика. Например:

Антибиотик	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32
Исследуемый	-	-	-	+	+
Тест С=10мкг/мл	-	+	+	+	+

 

C_{исслед.}= (Розвед. _{исслед.} / Розвед. _тест)* С_тест = 8/2*10=40мкг/мл

 

Этот метод сопоставим только в том случае, если эксперимент проводится с соблюдением стерильности (асептики), используют одни и те же среды для разведения, вносятся одни и те же количества клеток, соблюдается длительность инкубации, температура и т.д.

Еще одна разновидность биологических методов – диффузный метод. Основан на том, что антибиотики могут диффундировать в агар и вызывать зону задержки роста тест-культуры. Величина зоны задержки роста будет определяться составом агаровой пластины, рН, температурой, а также химической природой антибиотика, его молекулярной массой, и концентрацией антибиотика (чем выше концентрация, тем больше зона задержки). На основе диффузных методов основываются метод с использованием металлических цилиндров, метод с использованием лунок в агаре, метод с использованием бумажных дисков.

Метод с использованием металлических цилиндров: на поверхность агара, засеянного тест-клуьтурой, вставляют стандартные металлические цилиндры, которые сделаны из алюминия или нержавеющей стали, и вносят в них определенное количество испытуемого раствора, чередуя его с антибиотиками известной концентрации. Для известного антибиотика строят стандартную (калибровочную) кривую, где по оси ординат отмечают зону задержки роста в мм, а по оси абсцисс – соответствующую концентрацию антибиотика. По этой стандартной кривой определяют концентрацию исследуемого антибиотика в культуральной жидкости.

Метод с применением лунок в агаре основан на том же принципе. Лунки в агаре пробивают специальным пробочным сверлом, дно лунок герметизируют одной каплей расплавленного агара. Затем в эти лунки помещают разные концентрации стандартного и испытуемого антибиотика.

Метод с использованием бумажных дисков используют если антибиотик находится в культуральной жидкости. Из фильтровальной бумаги дыроколом вырезают диски, их стерилизуют, и стерильным пинцетом смачиваются в разных концентрациях антибиотика и накладываются на засеянную тест-культуру.

Химические и физико-химические методы. Преимущество: быстрые. Недостаток: уступают в точности биологическим методам, не ко всем антибиотикам можно использовать.

Относят колориметрические и спектрофотометрические методы. В основу колориметрических методов положен принцип превращения препарата или его группировок в окрашенные соединения. Спектрофотометрический метод основан на том, что антибиотики имеют характерные спектры поглощения в видимом свете (360-720 нм) и\или в УФ-области (200-360 нм). Для этого также обязательно строится калибровочная кривая для стандартного антибиотика с разными концентрациями (по оси ординат отмечают значение спектрофотометра – ОД).

Химические методы определения антибиотиков применяются очень редко. Существует несколько методик определения концентрации пенициллина, в основу которых положено поглощение йода продуктами гидролиза антибиотика.

Лабораторный регламент

Венцом лабораторных исследований является лабораторный регламент.

Лабораторный регламент – это технологический документ, которым завершаются исследования в лабораторных условиях по разработке метода получения антибиотика.

Он служит основой для разработки промышленного регламента.

Основная его задача – разработка оптимального метода производства антибиотического вещества.

Лабораторный регламент включает:

1) Характеристика АБ

· название антибиотика

· основное назначение

· краткое описание свойств препарата

· описание организма, который вырабатывает АБ

· методы определения биологической активности

· условия хранения

2) Прилагается технологическая схема

3) Указывается сырье и материал: требования к качеству сырья и материалов (ориентировка на отечественное сырье)

4) Аппаратурная схема производства

5) Изложение технологического процесса (описывается процесс получения АБ на основе завершенных научных и экспериментальных результатов, которые получены в лабораторных условиях). ТС описывается по этапам. Описывается обьем, концентрация, среда, рН, степень аэрации, условия перемешивания, пеногасители, температура, продолжительность процесса и т.д.

6) Отходы производства, технологические и вентиляционные выбросы в атмосферу, их использование и обезвреживание

· перечень возможных отходов и выбросов

· наличие в отходах ценных веществ и рекомендации к их использованию

· наличие вредных веществ с точки зрения загрязнения окружающей среды и способы их обезвреживания

7) Контроль производства

Указывают особые требования к оборудованию (герметичность ферментера и комплектаций и т.д.); режимы стерилизации сред, отдельных веществ и воздуха; методы анализа процесса биосинтеза АБ и готовой продукции

8) Техника безопасности, пожарная безопасность и производственная санитария: перечень веществ способных воспламеняться и взрываться. Все вещества, которые используются в процессе биосинтеза АБ, должны быть изучены с точки зрения безопасности.

9) Перечень производственных инструкций, которые должны быть разработаны на основе лабораторного регламента

10) Технико-экономические нормативы

· выход продукта и промежуточных продуктов

· удельные нормы расхода сырья и материалов

· удельные нормы энергозатрат (пара, воды, ЕЕ, сжатого воздуха)

11) Информационный материал

· биологические и физико-химические свойства вещества

· степень очистки

· фармакологические свойства

· сравнение с показателями идентичных зарубежных препаратов

· сведенья о патентной чистоте препарата с перечнем охраняющихся авторских свидетельств

· вредность веществ и меры предосторожности работы с веществами

Повышение антибиотикообразования микроорганизмов продуцентов:

Для этого используют 3 этапа:

- селекция найболее активных форм подцуентов антибиотиков

- подбор ПС и подбор условий культивирования которые обеспецивают увеличение выхода антибиотика продуцентом

- порведение направленнгого биосинтез антибиотиков