Титрование вируса. Расчет титра вируса по Риду и Менч

Недостатки метода:

1. более высокая доза вируса не всегда вызывает и более высокий инфекционный эффект

2. невозможно вычислить стандартную ошибку

3. создается впечатление, что работа велась с большим числом тест-объектов, чем фактически

19) определение титра вируса по бляшкам

Методика определения титра вируса в БОЕ

Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки (островки мертвых, не окрашенных клеток в слое окрашенных живых) в зараженных культурах клеток, залитых агаровой средой с красителем нейтральрот и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами.

Количество вируса при этом может быть измерено, соответственно, в бляшкообразуюших единицах (БОЕ) и оспообразующих единицах (ООЕ): 1 БОЕ = доза вируса, вызвавшая образование одной бляшки; 1 ООЕ = доза вируса, вызвавшая образование одной оспины. Методика определения титра вируса в БОЕ (ООЕ) заключается в следующем:

1.. Точно отмеренными и строго одинаковыми объемами исследуемого вируссодержащего материала заражают несколько культур клеток в матрасах или куриных эмбрионов на ХАО.

2. Подсчитывают количество образовавшихся в каждом матрасе бляшек или в каждом курином эмбрионе оспин.

3. Рассчитывают среднее арифметическое этого количества, которое равно количеству БОЕ или ООЕ вируса в заражающей дозе вируссодержащего материала.

4. Титр вируса (Т) рассчитывают по формуле:

Т = среднее арифметическое количество бляшек (оспин) / объем заражающей дозы х разведение вируссодержащего материала.

Считается, что счету поддаются бляшки и оспины, если их количество не превышает 50 на матрас или ХАО. Иногда, в случае высокой концентрации вируса в материале, бляшки в культуре клеток или оспины на ХАО могут сливаться, и их невозможно будет сосчитать. В таких случаях готовят несколько десятикратных разведений испытуемого материала и каждым разведением в одинаковых дозах заражают равные группы культур клеток или куриных эмбрионов, затем рассчитывают среднее арифметическое количество бляшек или оспин для каждого разведения. Титр вируса в этом случае рассчитывается по более сложной формуле:

Т = сумма средних арифметических количества бляшек (оспин) в каждом разведении / объем заражающей дозы х сумму разведений вируссодержащего материала

Метод титрования вирусов в БОЕ дает наиболее достоверные данные о концентрации вирусов, но он встречает технические трудности с подсчетом бляшек. Что касается оспин, то их использование ограничивается довольно немногочисленными вирусами, способными образовывать узелки на ХАО куриных эмбрионов.

75. Характеристика вируса гриппа лошадей и вызываемого им заболевания.

Возбудитель болезни. Возбудитель — РНК-содержащий вирус средних размеров (80...100нм), относящийся к семейству Orthomixoviridae. Структуры вириона покрыты наружной и внутренней оболочками. Наружная содержит два гликопротеида — гемагглютинин и нейраминидазу, определяющих узкую специфичность вирусов гриппа А. Гемагглютинин и нейраминидаза обусловливают важные свойства вирусов — токсиген-ность, иммуногенность, изменчивость. Вирус хорошо культивируется в куриных эмбрионах при заражении в аллантоисную и амниотическую полости.

Вирус слабоустойчив во внешней среде. В воздушной среде его жизнеспособность сохраняется несколько часов, а на окружающих предметах, в высохших каплях слизи — до 2 нед. Вирус чувствителен к ультрафиолетовым лучам.

Эпизоотология. В естественных условиях к вирусу восприимчивы лошади всех возрастов, но особенно тяжело болеют жеребята. Источник возбудителя инфекции — больные животные, которые в течение 2 нед выделяют вирус во внешнюю среду. Основной путь передачи возбудителя — аэрогенный, но может быть и контактный. Грипп лошадей чаще всего регистрируется в весенне-летний и осенний периоды, что связано с наиболее интенсивным передвижением животных, появлением неиммунного молодняка.

При неблагоприятных условиях содержания (сквозняки, сырость и др.) эпизоотические вспышки гриппа могут охватить до 60 % конепоголовья со значительным отходом (до 20 %) молодняка.

408 Патогенез. Легкие лошадей имеют особенности строения, которые отчасти обусловливают характер поражений при вирусных респираторных заболеваниях. Вирусы гриппа обладают выраженным тропизмом к эпителию дыхательных путей, особенно клеткам цилиндрического эпителия нижней носовой раковины и трахеи. Проникнув в них, вирус начинает интенсивно репродуцироваться, вызывая дистрофию, некроз, слущивание эпителия. Поврежденная слизистая оболочка становится проницаемой для вирусов, вовлекается подлежащая ткань с сосудистой сетью. В результате разрушения клеток развивается реактивное воспаление, что, однако, не препятствует дальнейшему прогрессированию инфекции. Процесс распространяется на нижние отделы респираторного тракта: развиваются эрозивный бронхит, перибронхит, периартериит, бронхопневмония. Могут возникать поражения и других органов — миокардит, энцефалопатия. Хотя вирусы гриппа довольно быстро разрушаются в организме, их токсичные субстанции, продукты распада клеток, бактерии устремляются в кровеносное русло, в результате чего возможны полнокровие, стазы, кровоизлияния. Существенные нарушения свертывающей и фибринолитической систем усугубляют развитие геморрагического синдрома. Синергизм перечисленных процессов способствует усилению протеолитической и цитотоксической активности вируса, деструкции капиллярных стенок, генерализации инфекции, развитию сливных пневмоний с отеком легких. Выделяющийся из клеток вирус поражает новые участки эпителия, и в патологический процесс вовлекается обширная поверхность слизистой оболочки. При слабой резистентности макроорганизма развивается вторичная инфекция с участием различных бактерий. У жеребых кобыл вследствие интоксикации может наступить гибель плода. В ответ на размножение вируса гриппа возникают специфические иммунные реакции организма, продуцируются местные антитела к вирусу, которые играют ведущую роль в защите организма при гриппозной инфекции.

Течение и клиническое проявление. Заболевание появляется через 1... 6 дней после заражения, в некоторых случаях отмечают более короткий инкубационный период — 18...20 ч. Клиническая картина гриппа у лошадей довольно разнообразная и зависит от условий содержания и эксплуатации животных, их иммунного статуса, биологических свойств возбудителя. В симптомокомплексе болезни преобладают катаральное воспаление слизистых оболочек, сухой кашель, повышенная чувствительность глотки и трахеи. Сдавливание верхних колец трахеи вызывает кашель. Лихорадка — непостоянный признак. Повышение температуры тела до 39...40 "С, покраснение слизистых оболочек глаз и полостей ноздрей, из которых возможны слизистые истечения, отмечают в течение 1...5 дней. Пульс учащен до 75 ударов в минуту, животное угнетено. При движении кашель усиливается. В холодную сырую погоду грипп протекает тяжело, часто осложняется вторичной бактериальной инфекцией. По тяжести проявления гриппа лошадей различают типичную, атипичную и злокачественную формы.

Типичная форма проявления гриппа лошадей характеризуется угнетением, воспалением слизистых оболочек глаз и носовой полости, увеличением окологлоточных лимфатических узлов, неглубоким кашлем. Затем происходит быстрый подъем температуры тела до 39,5...40°С, которая удерживается в течение 1...4 дней. Одновременно с лихорадкой появляется сухой болезненный кашель. При движении лошади кашель усиливается. Больные животные угнетены, у них снижается аппетит. Пульс учащен до 65...75 ударов в минуту.

Атипичную форму гриппа у лошадей часто диагностируют при заражении их вирусом первого серотипа. У животных наблюдают слабовыражен-ный серозный ринит, редкий неглубокий кашель. Лихорадка или отсутствует, или не регистрируется.

Злокачественное течение гриппа лошадей чаще всего вызвано вирусом второго серотипа. Кашель у лошадей сухой, отрывистый, болезненный. Во время кашля животное опускает голову, из носовых отверстий выделяются слизистые истечения. При исследовании сердечной деятельности

409обнаруживают аритмию, выпадение, расщепление или раздвоение тонов сердца. У выздоровевших лошадей изменение тонов и ритма сердечной деятельности сохраняется на протяжении нескольких месяцев. Напряженная работа больных лошадей в ряде случаев может привести к их гибели вследствие дистрофических изменений в сердце. При осложнении вторичной микрофлорой первичного процесса, вызванного вирусом гриппа, кашель становится коротким, глухим, болезненным. При дыхании появляются хрипы — влажные или сухие. Температура часто повышена в течение длительного времени — 1...2 нед. Показателем развития вторичной инфекции служат слизисто-гнойные истечения из носовых отверстий.

Патологоанатомические признаки. При вскрытии отмечают катаральное воспаление глаз и верхних дыхательных путей: гиперемию, отек слизистых оболочек и наличие катарального экссудата. Часто обнаруживают кровоизлияния и отеки в подкожной жировой клетчатке. Легкие серо-красного цвета, с участками уплотнения. На разрезе зоны воспаления серого цвета со слизистым и слизисто-гнойным содержимым.

Часто отмечают воспаление слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта. Сердечная мышца дряблая, грязно-розового цвета. Печень и почки с явлениями застоя и перерождения. Лимфатические узлы головы, шеи, средостенные увеличены. Нередко обнаруживаются фибринозные плевриты.

Диагностика и дифференциальная диагностика. Диагноз ставят на основании клинико-эпизоотологических данных, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований (окончательный диагноз).

Материалом для прижизненной лабораторной диагностики служит носовая слизь в первые дни болезни, а для посмертной — кусочки слизистой оболочки носа, глотки, трахеи, легких, взятые от павших лошадей.

Для серодиагностики используют парные пробные сыворотки крови, взятые у животных в первые дни болезни и спустя 2...3 нед с целью определения повышения уровня антител в РТГА. Выделение вируса осуществляют на куриных эмбрионах, а в дальнейшем проводят идентификацию в РГА и РТГА. Патологический материал также исследуют при помощи РИФ.

При дифференциальной диагностике грипп лошадей надо отличать от ринопневмонии, вирусного артериита и мыта.

Иммунитет, специфическая профилактика. У переболевших лошадей вырабатываются специфические антитела, но иммунитет возникает только к тому типу возбудителя, которым переболело животное. Для специфической профилактики используют инактивированную поливалентную вакцину. Эффективность вакцинации достигается при двукратном введении инактивированной вакцины и последующей ревакцинации не менее одного раза в год.

Профилактика. Для профилактики гриппа лошадей осуществляют комплекс следующих мероприятий: ввод в благополучные хозяйства больных и подозрительных по заболеванию гриппом лошадей строго запрещают; всех вновь поступивших лошадей карантинируют в течение 30 дней. В этот период их ежедневно подвергают клиническому осмотру; проводят профилактические ветеринарно-санитарные мероприятия.

При обнаружении у лошадей респираторного заболевания всех больных животных и животных, находящихся с ними в одном помещении, изолируют от остального конепоголовья и принимают меры для установления диагноза.

410 Лечение. Специфическое средство лечения больных гриппом лошадей не разработано. Больных освобождают от работы и изолируют от остального конепоголовья. За ними закрепляют отдельный обслуживающий персонал и подвергают симптоматическому лечению с применением бронхолитиков, сердечных средств, антибиотиков и сульфаниламидных препаратов. В дневное время в теплую сухую погоду их содержат на открытом воздухе.

Меры борьбы. При установлении диагноза на грипп лошадей хозяйство (конный завод, ипподром, конеферма, табун и т. д.) объявляют неблагополучным по этой болезни и вводят ограничения. При этом запрещают ввод в хозяйство и вывод из него лошадей, а также перегруппировку их внутри хозяйства, вывоз фуража и сбруи. Больных изолируют и лечат. Клинически здоровых лошадей неблагополучного хозяйства вакцинируют против гриппа.