Количественное определение азота в органических соединениях методом Къельдаля.

Количественное определение азота в органических соединениях методом Къельдаля.

Преимущества, ограничения и разновидности метода. Ход определения, химизм,

Уравнения для расчета.

Метод основан на минерализации ЛС под воздействием серной кислоты конц. при нагревании в присутствии катализаторов.

 

Преимущества:

- точность

 

Ограничения и недостатки:

- нельзя измерить точный белок

- скорость до неск. часов

- трудоемкость

 

Виды:

1. метод Кьельдаля (прямое титрование)
2. микрометод Кьельдаля (прямое титрование)

3. метод Кьельдаля (обратное титрование)

 

Ход определения:

Стадии:

- разложение образца с серной кислотой, азот превращается в аммония сульфат

- прибавление натрия гидроксида и отгонка с водяным паром выделившегося аммиака в приемник, содержащий кислоту для его поглощения (борная для прямого титр.)

- КОТ для количественного определения отогнанного аммиака (титрант – HCl; смешанный Ind - метиловый красный + метиловый синий (2:1); КТТ - переход окраски от зеленой к красно-фиолетовой) + проводят контрольный опыт

 

Химизм:

ЛС+H₂SO₄ (к) → (NH₄)₂SO₄+CO₂+H₂O

(NH₄)₂SO₄+2NaOH → Na₂SO₄+2NH₃↑+2Н₂О.

NН₃+Н₃ВО₃ → NН₄⁺+Н₂ВО₃^-

2NH₃+4H₃BO₃ → (NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

(NH₄)₂B₄O₇+2HCl+5H₂O → 4H₃BO₃+2NH₄Cl

Уравнения:

f_экв=1

T_HCl/N2=1,401 мг/мл

      (V_T - V_Tк.о)∙ K ∙ T_T/N2                                                                       

x_% = ------------------------- ∙ 100%

              a                                                                                        

Определение воды по К. Фишеру, значение метода для фармацевтического анализа.

Преимущества, ограничения и разновидности метода. Состав реактива, химизм

Взаимодействия с водой.

Метод основан на химическом взаимодействии воды с компонентами реактива Фишера.

 

Преимущества:

- селективность (как гигроскопич., так и кристаллизац. (связанная) вода

- универсальность (как в органич., так и в неорганич. соед-ях, в тв, жидких в-вах и газах)

- высокая точность в отличие от потери массы при высушивании

- наиболее удобный для субстанций и дозированных препаратов

- малое время анализа

 

Ограничения:

- неприменим для анализа соед-й, реагирующих с компонентами реактива (аскорб. к-та, сульфиды, гидрокарбонаты)

 

Виды:

1. объемный (реактив Фишера - р-р серы диоксида, йода и пиридина (буфер) в метаноле (растворитель) или йодсернистый реактив для методик Б/В)

2. кулонометрический для определения микроколичеств воды от 10 мкг до 10 мг

 

Химизм (в присут. воды):

I₂ + SO₂ + H₂O + 3C₅H₅N  2C₅H₅ N∙HI + C ₅ H₅NSO₃

C₅H₅NSO₃ + CH₃OH  C₅H₅ N∙HSO ₄ CH₃

      (V_T - V_к.о)∙ T                                                                       

x_% = ----------------------- ∙ 100%

              a                                        

T= a / V_{р-в Фишера} – V_к.о

На титрование каждого эквивалента воды затрачивается эквивалент йода.

КТТ определяют амперометрически или по изменению окраски раствора (от желтой до красновато-коричневой); параллельно проводят к.о. – титруют метанол б/в.

Рез-т должен быть в пределах 97,5-102,5 % для содержания 1000 мкг воды, 90,0-110,0 % для 100 мкг.

 

Определение аминокислот методами формольного и йодометрического титрования.

Комплексонометрия. Сущность метода. Титрант и индикаторы метода. Условия

Кислотно-основное титрование в среде протогенных растворителей. Обоснование выбора растворителя. Титрант и индикаторы метода. Условия титрования. Схемы реакций. Использование в фармацевтическом анализе.

Метод КОТ в неводных растворителях применяется для количественного определения веществ, представляющих собой кислоты, основания или соли, титрование которых в воде затруднено или невозможно из-за слабых кислотно-основных свойств, малой растворимости, наличия в объектах анализа компонентов или примесей, полностью блокирующих возможность или нарушающих селективность титрования в водной среде.

 

Ацидиметрия в среде протогенного растворителя – используется практически для всех азотосодержащих органических соединений и их солей, обладающих основными свойствами (кофеин, диазепам, димедрол, кофеин, адреналин, кодеин, атропина сульфат).

 

Метод основан на солеобразовании слабого органического основания с титрантом в среде протогенного растворителя, усиливающего основные свойства анализируемого вещества.

 

Растворители – уксусная к-та, уксусный ангидрид, муравьиная к-та или их сочетания.

Титрант – служит раствор хлорной кислоты (HClO4), индикаторами – кристаллический фиолетовый, тропеолин 00, малахитовый зеленый, метиловый фиолетовый.

Индикаторы - кристаллический фиолетовый, реже метиловый фиолетовый, малахитовый зеленый.

Химизм:

1)R ≡ N + CH3COOH → [ R ≡ N+ – H ] + CH3COO–(протонирование осн-я)

2)HClO4 + CH3COOH → CH3COOH2+ + ClO4-

3)[ R ≡ N+ – H ] + ClO4- → [ R ≡ N+ – H ]ClO4- (нейтрализация)

4) CH3COO- + CH3COOH2+ → 2 CH3COOH (восст-е р-ля)

—————————

R ≡ N + HClO4 → [ R ≡ N+ – H ]ClO4-

fэкв = 1

Кислотно-основное титрование в среде протофильных растворителей. Обоснование выбора растворителя. Титрант и индикаторы метода. Условия титрования. Схемы реакций. Использование в фармацевтическом анализе.

Метод КОТ в неводных растворителях применяется для количественного определения веществ, представляющих собой кислоты, основания или соли, титрование которых в воде затруднено или невозможно из-за слабых кислотно-основных свойств, малой растворимости, наличия в объектах анализа компонентов или примесей, полностью блокирующих возможность или нарушающих селективность титрования в водной среде.

 

Алкалиметрия в среде протофильного растворителя – по этому методу определяют ЛС, обладающие слабыми кислотными свойствами (барбитураты, судьфаниламиды, пр-ные аминокислот и фенолов), т.к. протофильный р-ль усиливает кислотные св-ва анализируемого в-ва.

 

Титранты - раствор метилата натрия или лития, растворы гидроксида натрия или калия в смеси метилового спирта и бензола.

 

Индикаторы - тимоловый синий, реже бромтимоловый синий.

 

Растворители - наиболее часто используется диметилформамид (ДМФА), пиридин, этилендиамин.

 

Испытание на стерильность.

1. Отбор образов для испытания

Отбирают образцы препарата в соот-ии с ОФС, учитывают общее количества единиц в серии.

2. Метод мембранной фильтрации: для определения стерильности ЛС

- обладающих выраженным антимикробным действием (исключение – нерастворимые в водных разбавителях ЛС)

- ЛС в емкостях вместимостью более 100 мл.  

Стадии: смачивание мембран, подготовка образцов и фильтрация содержимого всех емкостей через мембранные фильтры, отмывка мембранных фильтров соот-щим стерильным р-ром, добавление питательной среды и инкубирование посевов.

Метод прямого посева

- дляЛС, не обладающих антимикробным действием или антимикробное действие которых можно устранить разведением или инактивированием.

- ЛП, испытание которых невозможно выполнить методом мембранной фильтрации.

Если ЛП обладает антимикробным действием в условиях испытания, его нейтрализуют инактиваторами или увеличивая объем питательной среды.

Испытуемые образцы засевают непосредственно в питательные среды (жидкая тиогликолевая среда для выявления анаэробных и аэробных бактерий, для ИБП; или жидкая соевоказеиновая среда или среда Сабуро для выявления грибов и аэробных бактерий.

Условия инкубации посевов

Посевы инкубируют не менее 14 сут. при температуре около 32,5*С в жидкой тиогликолевой среде и при температуре ~22,5*С в жидких соевоказеиновой среде или среде Сабуро.

Методика выполнения.

Испытуемое ЛС вводят в ушную вену кролика, если в ФС не указан другой путь введения. Испытание проводят на группе из 3 кроликов, измерения температуры после введения ЛС проводят с интервалом не более 30 минут на протяжении трех часов. При других путях парентерального введения – на протяжении пяти часов.

Учет результатов.

По окончании каждого из этапов испытания определяют макс. изменение температуры тела каждого кролика по сравнению с исходным значением. Изменение температуры тела животного ниже исходной величины принимают за нулевое и не учитывают.

Определяют сумму индивидуальных максимальных повышений температур, полученные на разных этапах испытания, последовательно суммируют, и рез-ты сравнивают с уровнями, указанными в таблице ФС.

ЛС признают пирогенным, если рез-т на втором или последующих этапах испытания выше, чем величины, указанные в таблице, а также если в рез-те четырех этапов испытания зарегистрировано индивидуальное повышение температуры свыше 0,5ºС более, чем у трех кроликов из двенадцати.

 

Методика испытания.

1. Метод посева на питательные среды

2. Метод мембранной фильтрации

3. Метод наиболее вероятного числа

Инкубируют и подсчитывают выросшие колонии, выявляют специфические микроорганизмы.

Оценка результатов. После окончания времени инкубации просматривают посевы и отмечают появление типичного роста тест-микроорганизмов в контрольных чашках и пробирках (без препарата) и испытуемых (с различными разведениями препарата).

- если учет затруднен (помутнение или изменение окраски жидкой среды в результате взаимодействия ЛС с питательной средой), делают пересевы на агаризованные среды.

- при наличии роста E. coli, S. abony, P. aeruginosa, S. аureu s на питательных средах делают вывод об отсутствии антимикробного действия ЛП, обозначают знаком «+».

- при уменьшении кол-ва колоний на чашках или отсутствие роста тест-микроорганизмов, делают заключение о наличии у ЛП антимикробного действия, знаком «–».

 

Оценка результатов.

Расчет антимикробной активности испытуемых образцов может быть проведен 2 способами: графическим методом или путем непосредственного расчета с использованием соответствующих формул.

 

Испытание на стерильность.

Проводят в асептических условиях двумя методами: методом прямого посева или методом мембранной фильтрации.

Область применения. Различные ЛC, которые в соответствии с НД или ФС должны быть стерильными:

- препараты для инъекций,

- инфузий,

- глазных капель,

- пленок,

- фармацевтических субстанций

- вспомогательных в-в, включая биологические лекарственные препараты и их растворители.

 

Испытание на пирогенность.

Область применения – инъекционные р-ры и фарм. субстанции, из которых они изготавливаются.

Испытуемое ЛС вводят в ушную вену кролика.

 

Испытание на депрессорные вещества (понижающие АД).

Испытания проводят на кошках. Если в течение 60 сек после введения раствора ИО в исследуемой тест-дозе снижение артериального давления не превышает реакцию на введение СО в разведении 1, вещество прошло испытание

 

Отдельно проводят на гистамин.

Область – ЛС для парентерального применения.

СО - гистамина дигидрохлорид в 3 разведениях, на отрезке подвздошной кишки морской свинки.

ИО считают прошедшим испытание, если найденное содержание гистамина не превышает максимально допустимое, указанное в нормативной документации

Микробиологическая чистота.

Область применения – нестерильные ЛС (таблетки, капсулы, гранулы, растворы, суспензии, сиропы, мази, суппозитории и др., а также вспомогательные вещества), в т.ч. в ЛС, содержащих живые микроорганизмы, а также вспомогательные вещества и полупродукты.

1. Метод посева на питательные среды

2. Метод мембранной фильтрации

3. Метод наиболее вероятного числа

 

Бактериальные эндотоксины.

Область применения - ЛП, предназначенные для парентерального применения и фармацевтических субстанциях, используемых для их изготовления.

 

Проводят с помощью ЛАЛ- (специфический) или ТАЛ- реактива.

- гель-тромб метод, основанный на образовании геля;

- турбидиметрический метод, основанный на помутнении реакционной смеси после расщепления субстрата, содержащегося в ЛАЛ-реактиве;

- хромогенный метод, основанный на появлении окрашивания после расщепления синтетического пептид-хромогенного комплекса.

 

Виды тестов.

Область применения – ЛРС, содержащее сердечные гликозиды (листья и ЛП наперстянки, трава и ЛП горицвета, ЛРС и ЛП ландыша, семена и ЛП строфанта, ЛРС и ЛП желтушника серого).

Виды тестов.

Проводится различными методами: фотоколометрическим, спектрофотометрическим, флюориметрическим, газожидкостной хроматографии и биологической стандартизации.

Биологический метод.

Основан на способности сердечных гликозидов в токсических дозах вызывать систолическую остановку сердца животных.

Активность оценивают по сравнению со стандартным кристаллическим препаратом и выражают в ЕД (лягушачьих, кошачьих и голубиных).

За единицу (1 ЛЕД) принято наименьшее количество испытуемого вещества, способное вызвать систолическую остановку сердца у животных в течение 1 ч.

Валор сырья — это количество единиц действия в 1 г сырья.

 

Количественное определение азота в органических соединениях методом Къельдаля.

Преимущества, ограничения и разновидности метода. Ход определения, химизм,

Уравнения для расчета.

Метод основан на минерализации ЛС под воздействием серной кислоты конц. при нагревании в присутствии катализаторов.

 

Преимущества:

- точность

 

Ограничения и недостатки:

- нельзя измерить точный белок

- скорость до неск. часов

- трудоемкость

 

Виды:

1. метод Кьельдаля (прямое титрование)
2. микрометод Кьельдаля (прямое титрование)

3. метод Кьельдаля (обратное титрование)

 

Ход определения:

Стадии:

- разложение образца с серной кислотой, азот превращается в аммония сульфат

- прибавление натрия гидроксида и отгонка с водяным паром выделившегося аммиака в приемник, содержащий кислоту для его поглощения (борная для прямого титр.)

- КОТ для количественного определения отогнанного аммиака (титрант – HCl; смешанный Ind - метиловый красный + метиловый синий (2:1); КТТ - переход окраски от зеленой к красно-фиолетовой) + проводят контрольный опыт

 

Химизм:

ЛС+H₂SO₄ (к) → (NH₄)₂SO₄+CO₂+H₂O

(NH₄)₂SO₄+2NaOH → Na₂SO₄+2NH₃↑+2Н₂О.

NН₃+Н₃ВО₃ → NН₄⁺+Н₂ВО₃^-

2NH₃+4H₃BO₃ → (NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

(NH₄)₂B₄O₇+2HCl+5H₂O → 4H₃BO₃+2NH₄Cl

Уравнения:

f_экв=1

T_HCl/N2=1,401 мг/мл

      (V_T - V_Tк.о)∙ K ∙ T_T/N2                                                                       

x_% = ------------------------- ∙ 100%

              a