Микробиологическая диагностика. Метод Полева-Ермольевой состоит в посеве материала в три пробирки:

Метод Полева-Ермольевой состоит в посеве материала в три пробирки:

в 1-й - 1% пептонная вода;

во 2-й - 1% пептонная вода и агглютинирующая холерная О-сыворотка;

в 3-й - 1% пептонная вода с 0.5% растворимого крахмала.

Через 3-4 ч инкубации во 2-й пробирке в присутствии холерных вибрионов происходит агглютинация, в 3-й пробирке происходит разложение крахмала; при добавлении раствора Люголя через 6 ч отсутствует синее окрашивание.

Метод иммобилизации вибрионов специфической холерной О -

сывороткой.

  На предметное стекло наносят по одной капле испражнений, рвотных

масс или верхнего слоя пептонной воды. Первую каплю накрывают покровным стеклом (контроль), ко второй добавляют каплю 01 сыворотки в разведении 1:100,

перемешивают и также накрывают стеклом. Раздавленную каплю смотрят под микроскопом при увеличении 400-600х, используя фазово-контрастное устройство или конденсор темного поля. При наличии в исследуемом образце холерных вибрионов в первой капле наблюдают характерную подвижность, во второй - иммобилизацию отдельны х микробны х клеток и образование микроагглютинатов немедленно или в течение 1-2 мин.

Дифференциация биоваров V.cholerae 01

Признаки	Биовары V.cholerae 01
	eltor	cholerae
Лизабельность монофагами: eltorcholerae	+	-
Чувствительность к 30 Емл полимиксина	-(+)	+
Образование ацетилметилкарбинола	+-	-

Лечение.

Для этиотропной терапии используют антибиотики.

Профилактика.

Специфическая профилактика не разработана.

 

Стафилококки

Токсономия.

Cемейство	Micrococcaceae
Род	Staphylococcus
Виды	S. aureus (стафилококк золотистый), S. epidermidis (стафилококк эпидермальный), S. saprophyticus (стафилококк сапрофитный),

Мофрологичекие и тинкториальные свойства.

Грамположительные кокки, для которых характерно взаиморасположение скоплениями в виде гроздей винограда, т.к. они делятся во взаимоперпендикулярных плоскостях. Имеют микрокапсулу, спор не образуют, жгутиков не имеют.

Физиология.

Тип питания: хемоорганотрофы,Тип дыхания: факультативные анаэробы, Оптимальная температура 37^оС, рН 7.2-7.4:, длительность культивирования –

Культуральные свойства.

Хорошо растут на простых (МПА, МПБ), так и на сложных питательных средах с добавлением сыворотки и асцетической жидкости. На жидких средах дают равномерное помутнение, затем выпадает рыхлый осадок. На плотных средах образуют непрозрачные круглые ровные колонии. Кроме S- форм колоний могут образовывать R- формы.

На желточно-солевом агаре растут в виде радужно-матового венчика(фермент лецитиназа), колонии S формы –ровные, гладкие, блестящие, мелкие, желтоватого цвета

На молочно- солевом агаре дают пигмент, зависимости от вида:

S. aureus (стафилококк золотистый) – золотистый цвет

S. epidermidis (стафилококк эпидермальный)- белый, сливочный

S. saprophyticus (стафилококк сапрофитный)- бесцветные или серые колонии Среда обогащения - сахарный бульон.

Биохимические свойства.

Сахаролитическая активность: ферментируют лактозу, глюкозу,сахарозу, мальтозу, маннит, ксилозу, фруктозу без газа.

Протеолитические свойства: сероводород выделяют, разжижает желатин в виде воронку, каталазоположительные, оскидазоотрицательные, восстанавливают нитраты в нитриты

Антигенные свойства.

Общие АГ- О,К. Специфические –R, V.

Факторы патогенности.

Токсины:

Энтеротоксин

дерманекротоксин

летальный токсин

Ферменты патогенности:

Плазмокоагулаза

гиалуронидаза

лецитиназа

ДНК-аза

фибринолизин

каталаза

Эпидемиология.

Источник инфекции: здоровые носители и больные любой формой стафилококковой инфекции.

Механизмы передачи: респираторный, контактно-бы­товой, алиментарный.

Пути: алиментарным (при стафилококковых отравлениях), контактно - бытовым, воздушно - капельным и воздушно - пылевым.

Патогенез.

Стафилококки легко проникают в организм через мельчайшие повреждения кожи и слизистых оболочек и могут вызвать самые различные заболевания – от юношеских угрей до тяжелейшего перитонита, эндокардита, сепсиса или ептикопиемии, при которых летальность достигает 80 %. Стафилококки вызывают фурункулы, гидрадениты, абсцессы, флегмоны, остеомиелиты. Инфицирование стафилококками пищевых продуктов – частая причина пищевых отравлений. Стафилококки – главные виновники сепсиса, в том числе у новорожденных. В отличие от бактериемии (бактерии в крови), которая является симптомом болезни.

Клиническая картина.

Инкубационный период длится обычно от 4 до 16 дней, при пищевом отравлении стафилококковой этиологии — 2–4 ч, иногда сокращается до 30 мин и редко увеличивается до 6 ч, при СТШ — от 12 до 48 ч, при других формах, включая раневую, инфекции глаз и ЦНС — от 48 до 72 ч, у новорождённых — до 4–5 дней, у недоношенных — до 3 нед. Общепринятой классификации нет. Целесообразно дифференцировать местную стафилококковую инфекцию (с указанием локализации), генерализованную стафилококковую инфекцию и стафилококковые интоксикации.

• Локализованная (местная) стафилококковая инфекция:

- кожи и мягких тканей (фурункул, пиодермия, абсцесс, флегмона, гидраденит);

- ЛОР-органов (ангина, отит, синусит);

- органа зрения (ячмень, мейбомит, дакриоцистит);

- мочеполовых органов (пиелонефрит, цистит);

- артрит, остеомиелит;

- колит, энтероколит.

• Генерализованная стафилококковая инфекция:

- сепсис;

- пневмония, плеврит;

- эндокардит;

- менингит, абсцесс мозга.

• Стафилококковые интоксикации:

- стафилококковое пищевое отравление;

- стафилококковый ожогоподобный синдром, включая болезнь Риттера;

- СТШ.

Иммунитет.

Постинфекционный – клеточно-гуморальный, нестойкий, ненапряженный.

12.  Микробиологическая диагностика.

Материал для исследования – гной, кровь, моча, мокрота, испражнения.

Бактериоскопический метод: из исследуемого материала (кроме крови) готовят мазки, окрашивают по Граму. Наличие грам «+» гроздевидных кокков, располагающихся в виде скоплений.

Бактериологический метод: Материал засевают петлей на чашки с кровяным и желточно-солевым агаром для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37С в течении суток. На следующий день исследуют выросшие колонии на обеих средах. На кровяном агаре отмечают наличие или отсутствие гемолиза.Вокруг колоний стафилококков, обладающих лецитиназной активностью, образуются зоны помутнения с перламут­ровым оттенком. Для окончательного установления вида ста­филококка 2—3 колонии пересевают в пробирки со скошенным питательным агаром для получения чистых культур с последую­щим определением их дифференциальных признаков.S.aureus– «+»: образование плазмокоагулазы, летициназы. Ферментация:глк, миннита, образование а-токсина.

Бактериологическое исследование. В 1-й день иссле­дования петлей или шпателем сеют материал в чашки с 3—5 % кровяным, молочно-солевым и желточно-солевым агаром и помещают в термостат на 18—24 ч при температуре 37 °С.

Для выделения стафилококков используется сухая элективная среда, представляющая собой смесь гидро­лизина с истекшим сроком годности и аминопептида (1:1). На этой среде стафилококки развиваются быст­рее, чем на других питательных средах. Ее можно ис­пользовать в качестве основы для приготовления молочно-желточно-солевого агара с целью определения пигментообразования и лецитиназной активности.

На 2-й день исследования изучают колонии. На плотных средах стафилококки образуют выпуклые, не­прозрачные колонии средней величины, гомогенной или мелкозернистой структуры. Патогенные штаммы на кро­вяном агаре с 0,25—0,5 % глюкозы образуют вокруг колоний зону гемолиза. На желточно-солевом агаре большая часть патогенных стафилококков вызывает лецитовителлазную (желточную) реакцию, проявляющу­юся в образовании вокруг колонии зоны помутнения с радужным венчиком по периферии.

На чашках с молочно-солевым агаром учитывают образование пигмента у обладающих этим свойством штаммов. Он может быть золотистым, белым, лимонно-желтым.

При микроскопии в мазках обнаруживают типичные грамположительные стафилококки.

Дальнейшее исследование направлено на выделение чистой культуры стафилококка, для чего колонии пе­ресевают на скошенный агар.

Патогенные стафилококки кроме гемолитической и лецитиназной активности обладают способностью коагулировать плазму, вызывать некроз кожи у кролика, разрушать ДНК.

На 3-й день бактериологического исследования для выявления плазмокоагулазы выделенную культуру вно­сят в пробирку с цитратной плазмой кролика. Для это­го 10 мл крови, взятой из сердца кролика, наливают в пробирку с 1 мл 5 % раствора натрия цитрата; после центрифугирования или отстаивания отделяют плазму, разводят ее изотоническим раствором натрия хлорида 1:4 и разливают в стерильные пробирки по 0,5 мл. В настоящее время выпускают сухую нитратную плаз­му, которую перед применением разводят изотониче­ским раствором натрия хлорида. Посевы помещают в термостат при температуре 37 ^СС и, наблюдая за ними, отмечают время проявления коагуляции — свертывания плазмы. Из этой же культуры готовят миллиардную взвесь (1 млрд. микроорганизмов в 1 мл) и 0,2 мл ее вводят внутрикожно кролику со светлой шерстью. Спу­стя 1—2 суток на месте введения образуется некроз кожи.

Для проведения реакции плазмоагглютинации в про­бирку наливают плазму и на расстоянии 0,5 см от ее уровня растирают петлей чистую культуру стафилокок­ка, затем петлей вносят плазму в культуру. При поло­жительном результате отчетливо видны хлопья агглютината на стенке пробирки.

Для определения ДНК-азной активности в чашку Петри с агаром Хоттингера и ДНК засевают суточную культуру стафилококка маленькими бляшками. Через сутки в чашку вносят 5 мл IN раствора НС1 и через 3—5 мин учитывают зоны просветления, свидетельст­вующие о наличии ДНК-азы.

Лизоцимную активность стафилококков считают до­полнительным признаком патогенности. Для ее обна­ружения засевают бляшками суточную агаровую культуру стафилококка на плотную питательную среду с бактериальной суспензией Micrococcus lysodeicticus. При выделении лизоцима вокруг колонии стафилокок­ков образуются зоны лизиса.

 Навеску нуклеиновой кислоты из расчета 10 мг/мл ДНК помещают в дистиллированную воду, добавляя на каждые 20 мл воды 1 мл 0,8 % раствора едкого натра, и прогревают до полного растворения. К расплавленному и охлажденному до 50 °С МПА прибавляют этот раствор ДНК из расчета 1 мг/мл (на 9 мл МПА — 1 мл раствора ДНК). Такая среда может сохраняться после стерили­зации текучим паром до 2 месяцев. При проведении опыта агаро­вую среду с ДНК. расплавляют, добавляют к 10 мл среды 0,1 мл стерильного 10 % раствора кальция хлорида, перемешивают и вы­ливают на слой хорошо подсушенного питательного агара в чашке Петри.

Определение фаговара культур имеет важное эпи­демиологическое значение для выявления источника инфекции. Основной международный набор стафилокок­ковых фагов состоит из 21 типа, разделенных на 4 груп­пы. Для типирования используют стафилококковые фа­ги в двух рабочих разведениях: 1 ТР (тест-разведение), которое должно быть не ниже 10^-3, и 100 ТР — не ни­же 10^-1. Фаготипирование начинают с 1 ТР, в случае отрицательного результата используют разведение 100 ТР.

Для диагностики стафилококковых заболеваний мож­но использовать РИГА с эритроцитарным диагностикумом (эритроциты сенсибилизируют α-токсином стафи­лококка).

Обязательным также является определение чувстви­тельности выделенных стафилококков к антибиотикам для направленного лечения конкретного больного.

Для выделения гемокультуры стафилококков посев крови в сахарном бульоне выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 18—24 ч. Стафилококк вызывает равномерное помутнение среды. На 2-й день исследования из гемокультуры готовят мазки, затем пе­ресевают ее на скошенный МПА и в чашку с кровяным агаром для выявления гемолитической активности ста­филококков. На 3-й день исследования культуру ста­филококка, полученную на скошенном агаре, изучают так же, как культуру, выделенную из гноя или других материалов.

Для посева экссудата, гноя из невскрывшихся абс­цессов, флегмон используют МПА или 5 % кровяной агар. Посевы выдерживают в термостате при темпера­туре 37 °С в течение 18—24 ч, затем выделяют чистую культуру и проводят ее идентификацию вышеописанны­ми методами.

При пищевых отравлениях исследуемый материал микроскопируют, а затем сеют в чашки с МПА и в бульон, содержащий 1 % глюкозы (для обогащения). Материал, загрязненный посторонними микроорганиз­мами, сеют на кровяной агар, содержащий 6—7 % нат­рия хлорида. На этой среде стафилококки хорошо рас­тут и проявляют гемолитическое действие (они могут размножаться в присутствии 12 % соли и 50 % сахара), развитие энтеробактерий и бацилл задерживается, а протей не дает сплошного роста в виде пленки.

Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С. На следующий день изучают колонии, выделяют чистые культуры стафилококков и идентифицируют их. Патогенные стафилококки, вызывающие пищевые от­равления, образуют золотистый, реже белый пигмент, разжижают желатин, вызывают гемолиз и коагулиру­ют плазму.

Для выявления продукции энтеротоксина культуру стафилококка сеют в специальную питательную среду *. Посевы помещают в эксикатор с 20 % СО₂ и инкуби­руют при температуре 37 °С в течение 3—4 суток, а за­тем фильтруют через мембранные фильтры № 3 и 4. Полученный фильтрат объемом 10—15 мл смешивают с равным количеством теплого молока и скармливают котятам в возрасте 1—2 месяцев или же вводят фильт­рат им в желудок с помощью зонда. При наличии энте­ротоксина через 30—60 мин у котят возникает рвота — основной признак отравления, а через 2—3 ч появляет­ся понос, продолжающийся в течение 2—3 дней, в тя­желых случаях возможен летальный исход. Фильтрат можно вводить котятам внутрибрюшинно, после пред­варительного нагревания его при температуре 100 °С в течение 30 мин для инактивации термолабильных фрак­ций токсина. В настоящее время токсигенность выде­ленных культур стафилококков определяют в опыте in vitro с помощью реакции диффузной преципитации в геле.

Патогенные стафилококки могут находиться в воз­духе операционных, перевязочных, родильных палат и других больничных помещений. Для обнаружения их делают посевы воздуха на желточно-солевой агар **.

* На 1 000 мл дистиллированной воды добавляют 20 г пептона, 1 г однозамещенного фосфорно-кислого натрия, 1 г однозамещенного фосфорно-кислого калия, 5 г натрия хлорида, 0,1 г кальция хлорида, 0,2 г магния хлорида, 0,8 агар-агара (рН 7,0—7,2). Стерилизуют 20 мин при температуре 115 "С.

* К 100 мл расплавленного МПА, содержащего 7,5 г натрия хлорида, добавляют 20 мл стерильной желточной взвеси, переме­шивают и разливают в чашки. Для приготовления желточной взвеси желток куриного яйца асептически извлекают, отмывают от белка, помещают во флакон с бусами, добавляют 200 мл изотонического раствора натрия хлорида и встряхивают до полного смешивания; хранят в холодильнике.

Определение стафилококкового антитоксина в сыво­ротке крови приобретает большое значение при диагно­стике хронических стафилококковых инфекций (остео­миелит, септикопиемия и др.), когда бактериологиче­ские исследования, проводимые на фоне массивной антибиотикотерапии, как правило, остаются безрезуль­татными. В основе реакции лежит метод подавления гемолитической активности стафилококкового токсина антитоксином сыворотки больного. Для этого к стафи­лококковому токсину, взятому в определенной дозе, прибавляют сыворотку больного, разведенную 1:5, 1:10, 1:15, 1:20 и т. д., тщательно перемешивают и к смеси добавляют 0,05 мл эритроцитов кролика. Результаты реакции учитывают после пребывания пробирок в тер­мостате при температуре 37 °С в течение часа и затем в продолжение часа при комнатной температуре.

Количество сыворотки, в смеси с которой доза ток­сина, взятая в опыт, дает задержку гемолиза или сла­бый гемолиз, принимают за титр сыворотки.

У практически здоровых детей, так же как и у лиц, перенесших стафилококковую инфекцию кожи или ос­ложнившую хирургическое заболевание, титр стафило­коккового антитоксина не превышает 0,5—4 АЕ/мл. У больных с хроническими стафилококковыми инфек­циями титр, как правило, выше.

Для установления источника госпитальной инфекции выде­ляют чистые культуры стафилококка от больных и бактерионо­сителей, после чего проводят их фаготипирование с помощью набора типовых стафилофагов. Фаги разводят до титра, указан­ного на этикетке. Каждую из исследуемых культур засевают на питательный агар в чашку Петри газоном, высушивают, а за­тем петлей каплю соответствующего фага наносят на квадраты (по числу фагов, входящих в набор), предварительно разме­ченные карандашом на дне чашки Петри. Посевы инкубируют при 37 °С. Результаты оценивают на следующий день по нали­чию лизиса культуры.

Серологический метод: в случаях хронической инфекции, определяют титр анти-а-токсина в сыворотке крови больных.

Лечение.

Специфическая: противостафилококковый гамма –глобулин, бактериофаг, аутовакцины.

Неспецифическая: антибиотики

Профилактика.

Специфическая: стафило-протейно-синегнойную вакцину, стафилококковую убитую ВП-4 вакцину

Неспецифическая: санитарно-эпидемиологические мероприятия.

Стрептококки

Токсономия.