Работа 1. Построение кривой меченых митозов и расчет параметров клеточного цикла.

Теория вопроса

В жизни клетки имеется строго закономерная последовательность процессов, обеспечивающих ее деление. Период от возникновения клетки до ее деления митозом называют митотическим циклом. Периоды жизни клетки, в течение которых они выполняют специфические функции в отсутствии пролиферативных процессов, не относят к митотическому циклу, а включают в жизненный или клеточный цикл. Однако понятие «митотический цикл» и «клеточный цикл» часто отождествляют для тех популяций клеток, где эти циклы совпадают.

В митотическом цикле различают несколько периодов: собственно митоз (M), пресинтетический период (G₁), период синтеза ДНК (S), премитотический период (G₂). Расчленение интерфазы на указанные периоды удалось произвести главным образом благодаря авторадиографическим исследованиям с применением меченых предшественников ДНК, в частности, ³Н-тимидина. Меченый тимидин используется клеткой почти исключительно для синтеза ДНК. К числу больших достоинств ³Н-тимидина как меченого индикатора относятся его доступность для тканей, быстрота включения в структуры, синтезирующие ДНК, и относительно недолгое пребывание в свободном состоянии в организме.

На примере различных тканей млекопитающих было показано, что уже через несколько минут после внутривенного или внутрибрюшинного введения ³Н-тимидин исчезает из плазмы крови и включается в ДНК. Трешер (1966) расценивает однократное введение меченого тимидина в организм млекопитающих как импульсную, кратковременную «метку» продолжительностью около 30 мин.

Показано, что в различных тканях, а также в одной и той же ткани, находящейся в различных физиологических состояниях, соотношения между отдельными фазами клеточного цикла так же, как и продолжительность всего цикла, могут изменяться. При введении в организм ³Н-тимидина в любой популяции мечеными оказываются лишь те клетки, которые в данный момент синтезируют ДНК, т.е. находятся в S-периоде митотического цикла. Учитывая быстроту включения ³Н-тимидина в ДНК и его недолгое пребывание в организме, можно принять, что число новых клеток, переходящих в это время в S-период из пресинтетического периода G₁, незначительно и им можно пренебречь. Таким образом, клетки, находящиеся в момент введения меченого предшественника в периодах G₁ и G₂, а также в митозе, не будут содержать метки.

Продолжительность периодов митотического цикла можно определить графически, регистрируя изменение процента меченых митозов в различные промежутки времени после однократной инъекции ³Н-тимидина.

В течение некоторого времени после введения меченого предшественника в митоз продолжают вступать немеченые клетки, которые в момент введения метки находились в периоде G₂. Затем в митоз будут вступать меченые клетки, причем первыми в митоз войдут те клетки, которые будут помечены в конце периода S, а последними те, которые были помечены в начале периода S. Позже в митоз начинают вступать немеченые клетки из периода G₁.

В этом случае интервал времени от момента введения меченого предшественника до появления первых меченых митозов равен длительности периода G₂. Длительность периода S равна отрезку прямой между перпендикулярами, опущенными на ось абсцисс из точек пересечения восходящей и нисходящей частей кривой меченых митозов, с их 50 % уровнем (см рис.5-1).

 

 

 

 

 

Рис. 19-1. Изменения процента меченых митозов в различные сроки после однократного введения в организм ³ Н- тимидина

 

По оси абсцисс – время после введения ³Н-тимидина; по оси ординат – процент меченых митозов. Т – продолжительность митотического цикла; t_G2, t_S, t_М - продолжительность G₂, S и митоза.

Интервал времени между первым и вторым максимумами на кривой меченых митозов соответствует продолжительности митотического цикла (Т). Длительность пресинтетического периода G₁ определяют путём следующего расчёта:

                                   t_G1 =  Т – (t_G2 + t_S  + t_M)

Таким образом, с помощью метода авторадиографии, особенно применяя тимидин, меченный тритием, можно более точно изучить продолжительность митотического цикла клеток костного мозга и его периодов. Данные о митотическом цикле отдельных клеточных форм каждого из рядов костного мозга являются необходимым условием, как для изучения различного рода регуляционных воздействий, так и для правильного понимания патологических процессов, затрагивающих костный мозг.

 

Вопросы для обсуждения:

1.  В чем преимущества и недостатки основных приемов авторадиографического анализа клеточных циклов?

2. Как влияет ионизирующая радиация на продолжительность фаз клеточного цикла?