Инструкция к проведению практического занятия по теме «Исследование нормальных и патологических компонентов мочи»

Работа 1. Количественное определение белка в моче по методу Брандберга – Робертса – Стольникова

Принцип метода основан на реакции Геллера с концентрированной азотной кислотой. Установлено, что в растворах, содержащих 0,033 % белка, т.е. 0,033 г/л, через 2 или 3 минуты образуется характерное белое кольцо после наслаивания мочи на азотную кислоту.

  Материальное обеспечение: моча, 50% раствор азотной кислоты, пипетки, штативы, пробирки.

       Ход работы.

1. Приготовьте пять пробирок с мочой, разведенной в 10, 20, 30, 40 и 50 раз. Это будет первый ряд пробирок. Объем мочи в каждой пробирке – по 1 мл.
2. Приготовьте пять других пробирок, содержащих по 1 мл 50% раствора азотной кислоты. Это будет второй ряд пробирок.
3. В каждую из пробирок второго ряда осторожно наслаивайте по стенке слегка наклоненной пробирки мочу определенного разведения. Моча в результате меньшей относительной плотности наслаивается на кислоту. На границе двух жидкостей при наличии белка образуется белое кольцо, толщина и быстрота появления которого зависят от концентрации белка.
4. Результат учитывайте по пробирке с максимальным разведением мочи, при котором в пробирке появилось едва заметное кольцо между 2-й и 3-й минутой после наслаивания мочи на азотную кислоту. Например, кольцо появилось после второй минуты при разведении мочи в 30 раз. Следовательно, содержание белка в ней составляет: 0,033 х 30 = 0,099 г/л.

 

       Работа 2. Обнаружение кетоновых тел (ацетона) с помощью пробы Люголя

       Принцип метода. Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия соединение оранжево-красной окраски, которое после подкисления уксусной кислотой приобретает вишневый цвет.

       Материальное обеспечение: моча, 10% раствор гидроксида натрия, 10% раствор нитропруссида натрия, концентрированная уксусная кислота.

        Ход работы.

1. Налейте в пробирку 2 мл мочи.

2. Добавьте 3 – 4 капли 10% раствора нитропруссида натрия и 2 – 3 капли раствора 10% гидроксида натрия. Появляется оранжево-красное окрашивание.

3. Далее добавляйте в пробирку по каплям концентрированную уксусную кислоту. Окрашивание станет вишневым. Если ацетон в моче отсутствует, то при подкислении уксусной кислотой оранжево-красное окрашивание переходит в желтое (реакция на креатинин в моче). 

 

       Работа 3. Обнаружение ацетоуксусной кислоты в моче по реакции Герхарда

      Принцип метода: ацетоацетат образует с треххлористым железом соединение, окрашенное в вишневый цвет.

      Материальное обеспечение: моча, 5% раствор хлорного железа (ІІІ), пробирки, пипетки, штативы.

       Ход работы.

1. Налейте в пробирку 5 мл мочи.

2. Далее по каплям добавляйте в пробирку 5% раствор хлорного железа, выпадает осадок фосфатов железа._,. При наличии ацетоацетата от дальнейшего добавления хлорного железа появляется вишнево-красное окрашивание (реакция на енолы), постепенно бледнеющее при стоянии вследствие самопроизвольного декарбоксилирования ацетоуксусной кислоты.

 

       Работа 4. Обнаружение сахара в моче

Проба Троммера.

       Принцип метода  основан на способности альдегидоспиртов восстанавливать металлы.

       Материальное обеспечение: моча, 30% раствор едкого натра, 7% раствор сульфата меди, водяная баня, термометр, пробирки, пипетки, штативы.

       Ход работы

К 1 мл мочи добавьте 5 капель 30% раствора едкого натра и несколько капель 7% раствора сульфата меди до появления неисчезающего помутнения раствора, вызванного наличием гидроокиси меди. При нагревании до кипения выпадает красный осадок закиси меди Си₂О.

Проба Фелинга.

 Реакция Фелинга является модификацией реакции Троммера, но в ней вместо гидроокиси меди используются сульфат меди и щелочной раствор сегнетовой соли. Химизм реакции Фелинга тот же, что и реакции Троммера.

Материальное обеспечение: моча, 7% раствор сульфата меди, щелочной раствор сегнетовой соли, пробирки, пипетки, штативы, водяная баня, термометр.

       Ход работы

1. Приготовление реактива Фелинга: к 10 каплям 7% раствора сульфата меди добавьте 10 капель щелочного раствора сегнетовой соли.

2. К полученному реактиву Фелинга добавьте 20 капель исследуемой мочи, жидкость перемешайте и нагревайте до начала кипения. В присутствии глюкозы выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди.

Проба Ниландера.

Принцип метода: эта реакция основана на способности сахара восстанавливать гидроксид висмута до металла. Соли висмута особенно удобны для обнаружения сахара в моче, так как, в отличие от меди, висмут не восстанавливается мочевой кислотой.

Материальное обеспечение: моча, реактив Ниландера, пипетки, штативы, пробирки, водяная баня, термометр.

       Ход работы

1. В пробирку налейте 2 мл мочи и добавьте 1 мл реактива Ниландера.

2.  Прокипятите полученный раcтвор около двух минут. Пронаблюдайте появление сначала коричневого, а затем черного окрашивания, вызванного образованием осадка кристаллического висмута.

           

 

ВЫВОДЫ:

 

Подпись преподавателя:

 

      .

                                                                                         Приложение 1

Граф логической структуры

		БИОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОЧИ

 

Нарушения обмена веществ, вызывающие появление белка, углеводов, кетоновых тел в моче

Аминокислоты Креатинин Мочевая Соли                                           кислота аммония

            

 

 

 

 

                                                                                                                     

 

                                                                                           Приложение 2

Задания для самостоятельной работы

Почки – это парный орган, необходимый для поддержания постоянства внутренней среды организма и выведения конечных продуктов метаболизма.

Задание № 1

Какую из приведенных ниже функций не выполняют почки в организме человека?

     А. Выведение конечных продуктов обмена веществ

     Б. Регуляция водно-солевого обмена

     В. Поддержание осмотического давления

     Г. Регуляция артериального давления крови

     Д. Гидролиз мочевины до воды и оксида углерода

 Какие еще функции, кроме вышеперечисленных, выполняют почки?

 

Остановка функционирования почек несовместима с жизнью: если это происходит, то человек умирает на 4 – 6 день.

Почки содержат около 84% воды от общей массы, что свидетельствует о высокой интенсивности протекания метаболических процессов. Кроме того, почки используют до 10% от общего количества кислорода, необходимого организму. Главным источником энергетического материала для почек являются углеводы. В корковом веществе почек преобладает аэробный тип обмена веществ, в мозговом – анаэробный.

В почках происходит также интенсивный обмен белков и аминокислот, что сопровождается образованием аммиака.

 

Задание № 2

Какой метаболический процесс является главным источником аммиака в почках?

     А. Дезаминирование аминокислот

     Б. Трансаминирование аминокислот

     В. Гниение белков

     Г. Расщепление мочевины

     Д. Расщепление глутамина

Напишите уравнение реакции, которая, на Ваш взгляд, является правильным ответом на предыдущий вопрос и укажите название фермента. Какова дальнейшая судьба образующегося в почках аммиака?

 

Задание № 3

Какой фермент является органоспецифическим для почек?

     А. Лактатдегидрогеназа

     Б. Сукцинатдегидрогеназа

     В. Аспартатаминотрансфераза

     Г. Трансамидиназа (глицин-амидинотрансфераза)

     Д. Креатинфосфокиназа

Для синтеза какого вещества необходим этот фермент? Напишите уравнения реакций синтеза этого вещества, которые происходят в почках и печени. Укажите названия ферментов.

Какое соединение Вы получили?

     А. Индикан

     Б. Креатин

     В. Мочевину

     Г. Билирубин

     Д. Ренин

При фосфорилировании этого вещества образуется макроэргическое соединение «Х». Приведите его формулу и укажите макроэргическую связь. Как оно называется? Какой фермент участвует в реакции фосфорилирования?    

Вещество «Х» необходимо для быстрого образования АТФ, которая сможет обеспечить энергией интенсивно работающие мышцы в течение первых 2 – 5 секунд физической нагрузки.

При дефосфорилировании вещества «Х» образуется креатинин, который и выводится с мочой. Главным источником креатинина является мышечная ткань. Определение концентрации креатинина в моче используют для оценки функционального состояния почек.

Гиперкреатининурия имеет место при при приеме значительного количества мясной пищи, при травмах мышц, усиленной мышечной работе, синдроме сдавления тканей, а также при заболеваниях печени, пневмонии, лихорадочных состояниях.

Гипокреатининурия наблюдается в старческом возрасте, при миопатии, миозите, миоглобинурии, прогрессивной мышечной дистрофии, хроническом нефрите, почечной недостаточности, дегенерации почек.

Очень важная функция в почках принадлежит изоформам аланинаминопептидазы (ААП). Для почек характерна «ААП 3» изоформа. При участии этого фермента происходит гидролиз ди- и трипептидов, при этом происходит отщепление N-концевой аминокислоты. Появление в крови и моче изофермента «ААП 3» свидетельствует о поражении ткани почек.

  В основе образования мочи лежат три процесса: фильтрация, реабсорбция и секреция.

Для того чтобы количественно охарактеризовать закономерности выведения различных веществ с мочой, служит понятие клиренса, или очищения. Клиренс – это выраженное в миллилитрах количество плазмы крови, которое при прохождении через почки очищается от какого-либо вещества в течение минуты. Величину клиренса легко рассчитать, измерив концентрацию данного вещества в плазме крови и моче по формуле: C = (UV)/Р, где С – клиренс (мл/мин); U – концентрация вещества в моче; V – минутный диурез (мл/мин); Р - концентрация исследуемого вещества в плазме крови.

Почки человека вырабатывают в минуту фильтрат из 120 мл плазмы, поэтому если величина клиренса какого-либо вещества меньше этой величины, значит, оно ре- абсорбируется. Увеличение величины клиренса свидетельствует о секреции этого вещества в просвет нефрона.

Таким образом, величина клубочковой фильтрации равна клиренсу вещества, которое не реабсорбируется и не секретируется в канальцах нефрона. Таким веществом будет креатинин, который имеет максимально высокий клиренс из всех известных веществ.

Исследование мочи заключается в измерении количества, определении физических свойств, химического состава, а также в изучении микроскопической картины осадка.

В лаборатории исследуют утреннюю порцию мочи, суточное количество мочи.

 

Задание № 4

Какие из приведенных значений рН и плотности мочи здорового человека соответствуют норме?

     А. рН = 4,8; ρ = 1,001   

     Б. рН = 6,0; ρ = 1,021        

     В. рН = 8,5; ρ = 1,029

     Г. рН = 3,5; ρ = 1,020

     Д. рН = 8,0; ρ = 1,040

 

Задание № 5

Каким патологическим состояниям взрослого человека соответствуют приводимые ниже нарушения? Выберете правильные парные сочетания (буква – цифра).

1. Суточный диурез – 3,5 л                                              А. Анурия

1. Суточный диурез – 0,3 л                                              Б. Полиурия
2. Моча не образуется                                                      В. Олигурия
3. Недержание мочи                                                         Г. Никтурия
4. Ночной диурез преобладает над дневным                 Д. Энурез

Задание № 6

Выберете правильные парные сочетания (буква – цифра)

Цвет мочи	Причина, обусловившая изменение цвета
Соломенно-желтый	Много крови (свежей или частично измененной)
Бледный, водянистый	Гемоглобин в большом количестве
Темного пива	Норма
Красный или цвет мясных помоев	Хилурия
Темно-бурый	Сахарный диабет, несахарный диабет
Молочный	Билирубин, уробилиноген в большом количестве

 

Существует большая группа наследственных метаболических заболеваний, которые являются причиной нарушения здоровья у детей. Эти заболевания связаны с аномалиями экспрессии генов, приводящими к нарушениям синтеза белков, обычно ферментов, контролирующих ключевые этапы метаболизма. Для таких заболеваний характерно либо отсутствие продукта ферментативной реакции, либо накопление субстратов.

Клинические симптомы наследственных метаболических заболеваний, как правило, неспецифичны и включают нарушения роста, развития, нарушения питания, рвоту, гипотонию и судороги. При нарушениях синтеза мочевины у детей определяются неврологические симптомы. После рождения у детей с наследственными метаболическими заболеваниями может наблюдаться бессимптомный период и очень важно дифференцировать начало такого заболевания. Для постановки диагноза используется определение специфических метаболитов, в том числе и в моче.

Задание № 7

Заполните таблицу в соответствии с образцом.

Заболевание	Метаболиты, которые определяются в моче для диагностики	Нарушенный мета-болический процесс	Недостаточность фер-мента
Болезнь «кленового сиропа»	Альфа-кетокислоты, образующиеся при мета-болизме аминокислот с разветвленным углево-дородным скелетом	Метаболизм лейцина, изолейцина, валина	Декарбоксилаза альфа-кетокислот с разветв-ленным углеводородным скелетом
	Фенилпируват, фенил-лактат, фенилацетат
			Оксидаза гомогентизи-новой кислоты
Гомоцистинурия
Наследственная не-переносимость фруктозы	Фруктоза
Эссенциальная фрук-тозурия			Фруктокиназа
	Галактоза
			Нарушение синтеза пиримидиновых нуклео-тидов
	Аргининосукцинат
Гипераргининемия			Орнитиновый цикл
	Цитруллин

Задание № 8

Для подтверждения диагноза некоторых авитаминозовиспользуется определение концентрации в моче ряда метаболитов. Почему при дефиците тиамина в моче появляется большое количество альфа-кетокислот, в частности, пирувата? Какой метаболический процесс нарушается?

Почему при дефиците витамина В12 в моче в больших количествах выявляется метилмалоновая кислота (метилмалоновая ацидурия)? Какой метаболический процесс нарушается?

 

Задание № 9

У пациента выявлено препятствие оттоку желчи вследствие закупорки общего желчного протока. Какие биохимические изменения будут наблюдаться в его моче?

 

Задание № 10

У человека, которого укусила змея, появились признаки удушья, в моче обнаружен гемоглобин (красная моча с позитивной реакцией на кровь, но эритроциты отсутствуют). В крови резко снижено количество эритроцитов. Сыворотка крови пациента розового цвета. В чем заключается токсическое действие змеиного яда? Подтвердите Вашу точку зрения, приведя уравнение соответствующей реакции.