Методы воссоединения фрагментов ДНК

Для соединения фрагментов ДНК, полученных после обработки рестриктазой, используют отжиг, в результате которого образуются водородные связи между комплементарными основаниями липких кон- цов, с последующей обработкой ДНК-лигазой. Лига- за катализирует образование фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами. Наличие липких концов не является обязательным условием для вос- соединения фрагментов ДНК-лигазой. Имеются фер-

гибридных молекул. Один из них основан на ращепле- нии ДНК вектора несколькими рестриктазами, чтобы уменьшить вероятность самосборки вектора. Другой эффективный метод заключается в отщеплении конце- вых фосфатных групп от линейной ДНК вектора при действии щелочной фосфатазы. Образование лигазой кольцевых молекул ДНК в этом случае возможно толь- ко в присутствии фрагментов донорной ДНК, имею- щих неповрежденные 5′-фосфатные группы. (рис. 64)

Рис. 64. Схема использования линкерных молекул для конструирования гибридных ДНК. [27].

 

Идентичные взаимокомплементарные концы двух молекул ДНК, подлежащих объединению, могут быть получены при гидролизе этих молекул одной и той же рестриктазой. Однако часто возникает необходимость клонировать фрагменты ДНК, полученные расщепле- нием одной рестриктазой, в векторе, имеющем сайт расщепления для другой рестриктазы. Для этого су- ществует метод, позволяющий рекомбинировать прак- тически любые фрагменты ДНК. Он предусматривает использование линкеров — коротких синтетических

двухцепочечных олигонуклеотидов, имеющих сайты узнавания для определенной рестриктазы. Линкеры пришивают с помощью лигазы по концам молекулы ДНК, подлежащей клонированию, и обрабатывают рестриктазой, в результате чего образуются липкие концы. Этой же рестриктазой гидролизуют молекулу вектора. В результате отжига и обработки лигазой по- лучают рекомбинантные молекулы ДНК. Линкерная молекула может иметь больше, чем один сайт узнава- ния рестриктазой. Тогда ее называют полилинкером или адаптером. Применение таких молекул делает ре- стриктазно-лигазный метод рекомбинации ДНК уни- версальным, поскольку исходные фрагменты можно получить самыми различными способами.

Коннекторный метод воссоединения фрагмен- тов основан на свойстве фермента — терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы — достра- ивать нуклеотидные последовательности к 3′-ОН- концам фрагментов ДНК. К концам одного из соеди- няемых фрагментов ДНК присоединяют однонитевой полинуклеотид, например, поли-А (dA), а к кон- цам другого — комплементарный ему, например, поли-T (dT). Достроенные таким образом фрагменты смешивают и отжигают. Возможные бреши ликвиди- руют обработкой ДНК-полимеразой и лигазой, в ре- зультате чего получают ковалентно замкнутые коль- цевые молекулы.

 

Векторы

Векторами называют молекулы ДНК, способные переносить в клетку-реципиент чужеродную ДНК и обеспечить ее экспрессию. В векторные молеку- лы с помощью ферментов встраивают определенные гены. Такие молекулярные гибриды называются хи- мерами или рекомбинантными молекулами ДНК. Их вводят в реципиентные клетки, в результате чего про- исходит разделение молекул. Каждый из выделенных клонов содержит индивидуальную рекомбинантную ДНК. Эта процедура называется клонированием ре- комбинантных молекул ДНК (клонированием генов).

Чтобы стабильно существовать в клетке, вектор должен быть репликоном (автономно реплицировать- ся в клетке). Вектор должен иметь один или несколько маркеров, позволяющих фенотипически определять его присутствие в клетке-реципиенте. Для обеспе- чения воссоединения с ДНК донора в векторной мо- лекуле необходимо присутствие сайтов расщепле- ния рестриктазами, которые должны локализоваться в области, не существенной для репликации вектора. Кроме того важно, чтобы вектор допускал вставку до- норной ДНК различной молекулярной массы и давал большое число копий на клетку, что облегчает выде- ление и очистку рекомбинантной ДНК. Лучше всего разработана система векторов для E. coli в качестве реципиента. Она включает следующие типы векторов:

плазмиды, бактериофаг λ, космиды, фазмиды и бакте- риофаг М13.

Созданы векторы и для других микроорганизмов, в том числе важных для промышленности (Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces и др.). Особенно удобны двурепликонные (челночные) гибридные векторы, си- стемы репликации которых принадлежат плазмидам, имеющим разных хозяев. Они способны реплициро- ваться в различных клетках, например, в E. coli, дрож- жей или животных. Это позволяет все предваритель- ные операции по клонированию проводить в E. coli с последующим перенесением рекомбинантной ДНК в нужный объект.

 

Плазмиды

Плазмиды — это внехромосомные генетические элементы, которые существуют обычно в виде зам- кнутых кольцевых суперспиральных молекул ДНК (рис. 62). В качестве векторов используют чаще всего небольшие плазмиды размером 2-10 тпн. Плазмида со- держит специальный участок инициации репликации (ori).

В качестве маркеров плазмида может содержать гены, определяющие устойчивость бактерии к анти- биотикам. Вставка чужеродного (донорного) гена в маркерный ген приводит к инактивации последнего. Это позволяет отличить трансформированные клетки, получившие векторную плазмиду (утратившие устой- чивость к антибиотику), от клеток, получивших реком- бинантную молекулу (сохранившие устойчивость). Этот прием называется инактивацией маркера в ре- зультате вставки.

Созданы векторы, позволяющие производить пря- мой отбор клонов, несущих гибридные молекулы. Для этого используют гены, ответственные за гибель кле- ток в определенных условиях или кодирующие синтез фермента, определяющего окраску колонии на селек- тивной среде. Клонирование чужеродной ДНК в та- ком гене приводит к его инактивации, что проявляется в фенотипе.

Недостатком многих плазмид является снижение выхода рекомбинантов с ростом молекулярной массы вставки. Поэтому клонирование в плазмидах фрагмен- тов ДНК, превышающих 10 тпо малоэффективно.

Плазмиды вводят в бактериальные клетки мето- дом трансформации. В трансформации участвует одна из 1000-10000 молекул ДНК.