Принципы люминисцентной вирусоскопии и методы иммунофлуоресценции.

Вирусоскопия люминесцентная - метод выявления вирусов или вирусоспецифических антигенов с помощью люминесцирующих антисывороток.

Сущность явления люминесценции – при поглощении различных видов энергии молекулами некоторых веществ их атомы переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения.

Многие микроорганизмы обладают собственной флуоресценцией (первичной), однако ее интенсивность мала. Поэтому используются флуорохромы - специальные вещества, которые могут поглощать свет и являются люминесцентными (вторичная флуоресценция). Отечественная промышленность выпускает более 30 различных флуорохромов-люминесцентных красок (люминофоров), но не все они пригодны для мечения антител. В России наиболее часто применяются изоционат флуоресцеина или изотиоционат флуоресцеина, дающий зеленую флуоресценцию, изоционат родамина В или изотиоционат родамина В - оранжевая флуоресценция, и некоторые другие красители. Реже применяют алфадиметилесульфохлорид, дающий слабое желтое свечение.

Люминесцентный микроскоп оснащен специальной осветительной системой, которая излучает свет, вызывающий соответствующее свечение объектов.

Провоцировать подобное свечение объектов рекомендуется либо ультрафиолетом, либо сине-фиолетовыми лучами. Таким образом можно получить цветное изображение.

При помощи данной технологии меченные флуорохромами антитела идентифицируют антигены чужеродных организмов.

 

Иммунофлуоресценция.

Прямая иммунофлуоресценция – обнаружение вирусных антигенов в интересующем образце окрашиванием со специфическим меченым флуоресцином антивирусным антителом.

Срез замороженной ткани, клеточный мазок или клеточный монослой на покровном стекле обычно фиксируется метанолом или ацетоном и заливается флуоресцином, конъюгированным с противовирусным антителом. Затем несвязанные антитела отмывают. Клетки исследуют при помощи световой микроскопии, используя мощный источник ультрафиолетового света. Зеленый свет, выделяемый образцом, обнаруживается при помощи встроенного в окуляры фильтра, который поглощает весь случайный ультрафиолетовый и голубой свет.

Непрямая иммунофлуоресценция- противовирусные антитела являются не мечеными. Они связаны с антигеном и их распознают при помощи конъюгированного с флуоресцином антииммуноглобулина. Респираторные инфекции, вызванные парамиксовирусами, ортомиксовирусами, аденовирусами и герпесвирусами, определяются благодаря быстрой диагностики при помощи иммунофлуоресценции.

Также этот метод может применяться в отношении тканей, например, при биопсии для диагностики герпесвирусных заболеваний или при аутопсии для подтверждения бешенства животного, умерщвленного после укуса человека.

 

 

 

ВОПРОС 25.

Методы серологической диагностики вирусных болезней.                         

Серологические методы могут быть использованы для обнаружения в исследуемом материале как специфических антител, так и вирусных антигенов. Для этой цели исследуют парные сыворотки крови больных животных, для получения которых от каждого животного кровь для исследования на наличие специфических антител берут дважды с интервалом в 2—3 нед: в начале заболевания (в острой фазе) и в конце его (в период выздоровления — реконвалесценции).

Серологические реакции: 1. Реакция связывания комплемента.2. Реакция пассивной гемагглютинации и ее варианты (РНАг, РНАт).3. Реакция торможения гемагглютинации.4. Реакция гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс антиген + антитело в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах),ИФА и тд.

 

 

ВОПРОС 26.