Приготовление рабочей суспензии из патматериала, методы очистки вируса.

В лаборатории патматериал, его принято считать первичным, разделяют: одну часть полученного патматериала замораживают и хранят до окончания экспертизы для дополнительных исследований, из второй части готовят вирус-содержащую суспензию по следующей методике:

 

1. Приготовление вируссодержащей суспензии из органов и тканей:

- ткани измельчают и перетирают в фарфоровой ступке;

- готовят 10% суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса;

- центрифугируют при 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия (пенициллин, стрептомицин, нистатин, цефазолин, гентамицин);

- материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро;

- при отрицательном результате бактериологического контроля проводят исследование вируссодержащей суспензии; в случае положительного бактериологического контроля суспензию дополнительно обрабатывают антибиотиками и повторно ставят контроль.

Суспензию хранят при температуре минус 20-70°С.

2. Приготовление вируссодержащей суспензии из смывов, соскобов:

- тампон отполаскивают в транспортной среде, отжимают;

- центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия;

- материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро;

- из осадка делают мазок для постановки РИФ.

3. Приготовление вируссодержащей суспензии из фекалий:

- фекалии гомогенизируют в фосфатно-буферном растворе;

- центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия;

- материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро.

4. Приготовление вируссодержащей суспензии из кожных поражений.

- стенки папул, корочки растирают с фосфатно-буферным раствором;

- центрифугируют 1500-3000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость отбирают и освобождают от контаминантов антибиотиками широкого спектра действия;

- материал подвергают бактериологическому контролю путём посева на МПА, МПБ, МППБ, среду Сабуро.

ВОПРОС 14.

Методы концентрации вирусов.            

Методы концентрации вирусов в рабочей суспензии.

При многих вирусных инфекциях наблюдается феномен посмертной аутостерилизации. В таком случае вирус настолько мал, что выделить его не удается, поэтому применяют концентрацию вируса, используют 3 метода:

- метод дифференциального центрифугирования;

- метод фильтрации рабочей суспензии через коллоидные фильтры;

- адсорбционный метод.

 

1. Метод дифференциального центрифугирования:

Метод основан на том, что вирусные частицы в жидкости значительно легче суспензируются, чем обрывки тканей или микроорганизмов. Метод заключается в следующем:

- 10% рабочую суспензию разливают в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют при 2,5 - 3 тыс. об/мин в течение 10-15 мин. (оседают твердые частицы и тканевые элементы);

- берется 2/3 надосадочной жидкости, центрифугируется при 6,0 – 8,0 тыс. об/мин - 15-20 мин. (оседают микроорганизмы);

- берется 2/3 надосадочной жидкости, центрифугируется 20–25 тыс. об/мин - 20-25 мин. (оседают вирусы).

- осторожно удаляют 2/3 надосадочной жидкости, встряхивают, вирус суспензируется и его концентрация в 2-3 раза будет выше, чем в первоначально приготовленной рабочей суспензии, и он будет очищен от тканевых элементов и микроорганизмов.

 

2. Метод фильтрации рабочей суспензии через коллоидные фильтры:

Поры коллоидных фильтров пропускают только воду, но не пропускают микробы и вирусы. При фильтрации 10% рабочей суспензии вирусы адсорбируются на поверхности фильтра, микробы нет. Фильтр промывают фосфатно-буферным раствором. При этом удаляются крупные тканевые частицы и значительная часть микрофлоры. Фильтр измельчают и помещают в меньший объемом стерильного фосфатного буфера. Центрифугируют 10-15 минут при 8000 об/мин. При этом в осадок уйдут частицы коллоидного фильтра, бактериальная микрофлора. А в надосадочной жидкости останется вирус, и его концентрация будет больше, чем в исходном растворе.

 

3. Адсорбционный метод (по Соколову):

Метод основан на способности вирусов адсорбироваться на поверхности эритроцитов. Спектр адсорбционной способности вируса широк – частицы глины, гипса, угля, гидроокись алюминия и др., что находит применение в вирусологической практике.

Сущность метода: берется 20 мл вируссодержащей жидкости, добавляется 1%-ая взвесь отмытых эритроцитов кур или других животных (1% к объему жидкости). Смесь встряхивают, помещают в холодильник при температуре +40℃...+50℃ на 2-3 часа. При этом вирус адсорбируется на эритроцитах. Смесь центрифугируют при 1,5 - 2,5 тыс. об/мин - 5-10 минут, в результате чего в осадок выпадают эритроциты вместе с адсорбированным вирусом. Надосадочную жидкость сливают, добавляют к осадку 2 мл физиологического раствора, осадок встряхивают, помещают в термостат при температуре 370℃ на 2 часа, где происходит элюция (сползание) вируса с эритроцитов. Суспензию центрифугируют при 1,5 - 2,0 тыс. об/мин - 5-10 минут. В осадок выпадают эритроциты, а в надосадочной жидкости находится вирус концентрация которого в 10 раз больше, чем в исходном вируссодержащем материале.

 

ВОПРОС 15.