Это серьезные ошибки проектирования, поскольку тест не может различить вирус целиком и вирусные фрагменты. Тест нельзя использовать в качестве диагностики SARS-вирусов.

Рисунок 2: Относительное положение мишеней ампликонов на коронавирусе SARS и геноме нового коронавируса 2019 года. ORF: открытая рамка считывания; RdRp: РНК-зависимая РНК-полимераза. Цифры под ампликоном - это положения генома согласно SARS-CoV, NC_004718 [1];

Рисунок 3: Тест с помощью инструмента для создания димеров праймеров от Thermofischer показывает, что прямой праймер RdRp имеет 3'-прайм-гомологию 6 п.н. с Sarbeco E Reverse (левое поле). Другой тест показывает, что существует идеальное соответствие одного из N-праймеров клиническому патогену (Pantoea), обнаруженному у пациентов с ослабленным иммунитетом (правое поле).

 

Температуры реакции

2а) Температура плавления ДНК (> 92 °).

Адекватно рассмотрено в статье Кормана-Дростена.

2б) Температура амплификации ДНК.

Адекватно рассмотрено в статье Кормана-Дростена.

2c) Ошибочные данные GC и Tm

Температура отжига определяет, при какой температуре праймер прикрепляется / отсоединяется от целевой последовательности. Для эффективной и специфической амплификации содержание GC в праймерах должно соответствовать минимум 40% и максимуму 60% амплификации. Как указано в таблице 3, три праймера, описанные в статье Кормана-Дростена, не находятся в пределах нормального диапазона для содержания GC. Два праймера (RdRp_SARSr_F и RdRp_SARSr_R) имеют необычные и очень низкие GC-значения 28% -31% для всех возможных вариантов колебательных оснований, тогда как праймер E_Sarbeco_F имеет GC-значение 34,6% (Таблица 3 и вторая панель Таблицы 3).

Следует отметить, что содержание GC в значительной степени определяет связывание с его конкретной мишенью из-за трех водородных связей в спаривании оснований. Таким образом, чем ниже GC-содержание праймера, тем ниже его способность связываться с его конкретной последовательностью гена-мишени (то есть с геном, который необходимо обнаружить). Это означает, что для распознавания целевой последовательности мы должны выбрать температуру, которая как можно ближе к фактической температуре отжига (значение наилучшей практики), чтобы праймер не отслоился снова, и в то же время специально выбрать целевая последовательность.

Если значение Tm очень низкое, как это наблюдается для всех шатких вариантов обратных праймеров RdRp, праймеры могут неспецифично связываться с несколькими мишенями, снижая специфичность и увеличивая потенциальные ложноположительные результаты.

Температура отжига (Tm) является решающим фактором для определения специфичности / точности процедуры qPCR и важна для оценки точности протоколов qPCR. Рекомендация по передовой практике: оба праймера (прямой и обратный) должны иметь почти одинаковое значение, предпочтительно одинаковое значение.

Мы использовали свободно доступное программное обеспечение для создания праймеров Primer-BLAST [12, 25], чтобы оценить лучшие практические значения для всех праймеров, использованных в статье Кормана-Дростена (таблица 3). Мы попытались найти значение Tm, равное 60 ° C, при этом аналогичным образом искали максимально возможное значение GC% для всех праймеров. Максимальное различие Tm 2 ° C внутри пар праймеров считалось приемлемым. Тестируя пары праймеров, указанные в статье Кормана-Дростена, мы наблюдали разницу в 10 ° C по отношению к температуре отжига Tm для пары праймеров 1 (RdRp_SARSr_F и RdRp_SARSr_R). Это очень серьезная ошибка, которая делает протокол бесполезным в качестве специального диагностического инструмента.

Дополнительное тестирование показало, что только пара праймеров, разработанная для амплификации N-гена (N_Sarbeco_F и N_Sarbeco_R), достигла адекватного стандарта для работы в диагностическом тесте, поскольку она имеет достаточное содержание GC и разницу Tm между праймерами (N_Sarbeco_F и N_Sarbeco_R).) составляет 1,85 ° C (ниже критического максимума разницы в 2 ° C). Важно отметить, что это ген, который не тестировался в вирусных образцах (таблица 2) и не использовался в качестве подтверждающего теста. Помимо сильно изменяющихся температур плавления и вырожденных последовательностей в этих праймерах, существует еще один фактор, влияющий на специфичность процедуры: dNTP (0,4 мкМ) в 2 раза выше, чем рекомендовано для высокоспецифичной амплификации. В реакционную смесь также добавляют дополнительное количество сульфата магния. Эта процедура в сочетании с низкой температурой отжига может привести к неспецифическим усилениям. Если для количественной ПЦР требуется дополнительное количество магния, следует дополнительно изучить специфичность анализа.

Описанные здесь ошибки проектирования настолько серьезны, что маловероятно, что конкретная амплификация генетического материала SARS-CoV-2 будет происходить с использованием протокола статьи Кормана-Дростена.

Таблица 3: GC-содержание праймеров и зондов (адаптировано из статьи Кормана-Дростена; аберрации от оптимизированного GC-содержания выделены. На второй панели показан список всех значений передовой практики Primer-BLAST для всех праймеров и зондов, используемых в статья Кормана-Дростена, подготовленная профессором д-ром Ульрике Каммерер и ее командой

 

3. Количество циклов амплификации.

Следует отметить, что нигде в статье Кормана-Дростена нет упоминания о положительном или отрицательном результате теста или о том, что определяет положительный или отрицательный результат. Эти типы вирусологических диагностических тестов должны основываться на СОП, включая проверенное и фиксированное количество циклов ПЦР (значение Ct), после которых образец считается положительным или отрицательным. Максимально надежное значение Ct составляет 30 циклов. Выше Ct 35 циклов следует ожидать быстрого увеличения числа ложных срабатываний.