Внешняя экспертная оценка теста rtpcr для обнаружения sars-cov-2 выявляет 10 основных научных недостатков на молекулярном и методологическом уровне: последствия ложноположительных результатов.

Этот подробный отчет о проверке был официально представлен в редакцию Eurosurveillance 27 ноября 2020 года через портал для подачи материалов. К настоящему отчету о проверке прилагается письмо с просьбой об отзыве, подписанное всеми основными и соавторами. Имя и фамилия - это первый и второй основные авторы. Все промежуточные имена являются соавторами.

Внешняя экспертная оценка теста RTPCR для обнаружения SARS-CoV-2 выявляет 10 основных научных недостатков на молекулярном и методологическом уровне: последствия ложноположительных результатов.

Питер Боргер (1), Бобби Раджеш Малхотра (2), Майкл Йидон (3), Клэр Крейг (4), Кевин МакКернан (5), Клаус Стегер (6), Пол МакШихи (7), Лидия Ангелова (8), Фабио Франчи (9), Томас Биндер (10), Хенрик Ульрих (11), Макото Охаши (12), Стефано Скольо (13), Марджолейн Дусбург-ван Клеффенс (14), Доротея Гилберт (15), Райнер Клемент (16), Рут Шруфер (17), бербер В. Пиксма (18), Ян Бонте (19), Бруно Х. Далле Карбонар (20), Кевин П. Корбетт (21), Ульрике Каммерер (22)

АННОТАЦИЯ

В публикации под названием «Обнаружение нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени» (Eurosurveillance 25 (8) 2020) авторы представляют рабочий процесс диагностики и протокол ОТ-КПЦР для обнаружения и диагностики 2019-nCoV. (теперь известный как SARS-CoV-2), который, по их утверждениям, прошел валидацию, а также является надежной диагностической методологией для использования в лабораторных условиях общественного здравоохранения.

В свете всех последствий, вытекающих из этой публикации для обществ во всем мире, группа независимых исследователей выполнила поэтапный обзор вышеупомянутой публикации, в котором 1) все компоненты представленного дизайна теста были перекрестно проверены, 2) Рекомендации протокола RT-qPCR были оценены с учетом надлежащей лабораторной практики, а 3) параметры были изучены по соответствующей научной литературе, охватывающей эту область.

Опубликованный протокол RT-qPCR для обнаружения и диагностики 2019-nCoV и рукопись страдают многочисленными техническими и научными ошибками, включая недостаточный дизайн праймеров, проблемный и недостаточный протокол RT-qPCR и отсутствие точной проверки теста. Ни представленный тест, ни сама рукопись не отвечают требованиям для приемлемой научной публикации. Далее не упоминаются серьезные конфликты интересов авторов. Наконец, очень короткий промежуток времени между подачей и принятием публикации (24 часа) означает, что систематический процесс рецензирования здесь либо не проводился, либо имел проблематичное низкое качество. Мы предоставляем неопровержимые доказательства ряда научных несоответствий, ошибок и недостатков.

Учитывая представленные здесь научные и методологические недостатки, мы уверены, что у редакции Eurosurveillance нет другого выбора, кроме как отозвать публикацию.

КРАТКИЙ ОТЧЕТ ОБ ОБЗОРЕ

В этой статье будут показаны многочисленные серьезные недостатки в статье Кормана-Дростена, значимость которых привела к ошибочной диагностике инфекций, приписываемых SARS-CoV-2 и связанных с заболеванием COVID-19, во всем мире. Мы сталкиваемся с жесткими ограничениями, которые разрушили жизни и средства к существованию многих людей, ограниченным доступом к образованию, и эти ограничения, введенные правительствами по всему миру, являются прямым нападением на основные права людей и их личные свободы, что приводит к сопутствующему ущербу для экономики целых стран. мировой масштаб.

Молекулярно-биологические подтверждения; амплифицированные продукты ПЦР должны быть проверены либо путем прогона продуктов в геле с линейкой ДНК, либо путем прямого секвенирования ДНК.

Следует указать положительный и отрицательный контроли для подтверждения / опровержения обнаружения конкретного вируса.

ЗАДНИЙ ФОН

Авторы представляют предысторию своей научной работы следующим образом: «Продолжающаяся вспышка недавно возникшего нового коронавируса (2019-nCoV) представляет собой проблему для лабораторий общественного здравоохранения, поскольку изоляты вируса недоступны, в то время как появляется все больше свидетельств того, что вспышка более распространена, чем изначально думали, а международное распространение через путешественников уже происходит».

По данным BBC News [4] и Google Statistics [5], 21 января 2020 года во всем мире погибло 6 человек - в день отправки рукописи. Почему авторы решили, что это вызов для лабораторий общественного здравоохранения, хотя в то время не было существенных доказательств того, что вспышка была более распространенной, чем предполагалось изначально?

В качестве цели авторы заявили о разработке и внедрении надежной диагностической методологии для использования в лабораторных условиях общественного здравоохранения без наличия вирусного материала. Кроме того, они признают, что «Настоящее исследование демонстрирует огромный потенциал реагирования, достигнутый за счет координации академических и государственных лабораторий в национальных и европейских исследовательских сетях».

Б) МЕТОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

Праймер и конструкция зонда

1a) Ошибочные концентрации праймера

Протоколы надежных и точных ПЦР-тестов обычно разрабатываются с использованием от 100 до 200 нМ на праймер [7]. В статье Кормана-Дростен мы наблюдаем необычно высокие и разные концентрации праймеров для нескольких праймеров (таблица 1). Для пар праймеров RdRp_SARSr-F и RdRp_SARSr-R описаны 600 нМ и 800 нМ, соответственно. Точно так же для набора праймеров N_Sarbeco_F и N_Sarbeco_R они рекомендуют 600 нМ и 800 нМ соответственно [1].

Должно быть ясно, что эти концентрации слишком высоки, чтобы быть оптимальными для конкретных амплификаций генов-мишеней. В этом протоколе нет конкретной причины использовать эти чрезвычайно высокие концентрации праймеров. Скорее, эти концентрации приводят к усилению неспецифического связывания и амплификации продукта ПЦР.

Таблица 1: Праймеры и зонды (адаптировано из статьи Кормана-Дростена; ошибочные концентрации праймеров выделены)

 

1b) Неуказанные («шаткие») последовательности праймеров и зондов.

Для получения воспроизводимых и сопоставимых результатов важно четко определить пары праймеров. В статье Кормана-Дростена мы наблюдали шесть неуказанных положений, обозначенных буквами R, W, M и S (Таблица 2). Буква W означает, что в этой позиции может быть либо A, либо T; R означает, что может быть либо G, либо A; M указывает, что позиция может быть A или C; буква S указывает на то, что на этой позиции может быть буква G или C.

Такое большое количество вариантов не только необычно, но и сбивает с толку лаборатории. Эти шесть неуказанных положений могут легко привести к созданию нескольких различных альтернативных последовательностей праймеров, которые не относятся к SARS-CoV-2 (2 различных праймера RdRp_SARSr_F + 8 различных зондов RdRp_SARS_P1 + 4 различных RdRp_SARSr_R).
Изменения конструкции неизбежно приведут к результатам, даже не связанным с SARS CoV-2. Следовательно, сбивающее с толку неспецифическое описание в статье Кормана-Дростена не подходит в качестве стандартного рабочего протокола. Эти неуказанные позиции должны были быть разработаны недвусмысленно.

Эти шаткие последовательности уже вызвали беспокойство в этой области и привели к письму в редакцию, написанному Pillonel et al. [8] относительно явных ошибок в описанных последовательностях. Эти ошибки очевидны в Corman et al. добавка.

Таблица 2: Праймеры и зонды (адаптировано из статьи Кормана-Дростена; неуказанные («шаткие») нуклеотиды в праймерах выделены)

Протокол ВОЗ (рис. 1), который непосредственно заимствован из статьи Кормана-Дростена, заключает, что для подтверждения наличия SARS-CoV-2 необходимо идентифицировать два контрольных гена (гены E и RdRp). в пробирке. Следует отметить, что ген RdPd имеет одно неопределенное положение («шаткое») в прямом праймере (R = G / A), два неопределенных положения в обратном праймере (R = G / A; S = G / C) и он имеет три неопределенных положения в датчике RdRp (W = A / T; R = G / A; M = A / C).
Таким образом, для гена RdPd можно синтезировать два разных прямых праймера, четыре разных обратных праймера и восемь различных зондов. Всего существует 64 возможных комбинации праймеров и зондов!

В документе Кормана-Дростена также указывается третий ген, который, согласно протоколу ВОЗ, не прошел дальнейшей валидации и не был признан необходимым:

«Следует отметить, что анализ N-гена также показал хорошие результаты, но не подвергался дальнейшей интенсивной проверке, поскольку был немного менее чувствителен».

Это было досадным упущением, так как лучше всего было бы использовать ПЦР всех трех генов в качестве подтверждающих анализов, и это привело бы к почти достаточному протоколу диагностического инструмента обнаружения вирусной РНК. Три подтверждающих этапа анализа, по крайней мере, минимизируют ошибки и неопределенности на каждом этапе складывания в отношении «шатких» пятен.
(Тем не менее, протокол все равно не соответствовал бы любой «хорошей лабораторной практике», если учесть все другие ошибки проектирования).

В его нынешнем виде, к сожалению, анализ N-гена не предлагается ни в рекомендации ВОЗ (рис. 1) в качестве обязательного и важного третьего подтверждающего шага, ни в документе Кормана-Дростена как важный необязательный аргумент «для рутинного рабочего процесса». (Таблица 2).

Следовательно, почти во всех испытательных процедурах во всем мире использовалось только 2 совпадения праймеров вместо всех трех. Такой надзор делает весь протокол испытаний бесполезным с точки зрения предоставления точных результатов испытаний, имеющих реальное значение в продолжающейся пандемии.

Рисунок 1: Подтверждающий анализ N-гена не подчеркивается как необходимый третий шаг в официальной рекомендации ВОЗ по протоколу Дростена-Кормана, приведенной ниже [8], и не требуется как решающий шаг для повышения точности теста в публикации Eurosurveillance.

1c) Ошибочное содержание GC (обсуждается в 2c вместе с температурой отжига (Tm))

1г) Обнаружение вирусных генов

ОТ-ПЦР не рекомендуется для первичной диагностики инфекции. Вот почему тест ОТ-ПЦР, используемый в повседневной клинической практике для выявления COVID-19, не рекомендуется для диагностики COVID-19 на нормативной основе.

« Клиницисты должны осознавать повышенную точность и скорость молекулярных диагностических методов для диагностики инфекций, но также понимать их ограничения. Лабораторные результаты всегда следует интерпретировать в контексте клинической картины пациента, и для получения надежных результатов необходимы соответствующее место, качество и время сбора образцов ». [9]

Однако его можно использовать, чтобы помочь врачу в дифференциальной диагностике, когда он или она должен различать различные инфекции легких (грипп, Covid-19 и SARS имеют очень похожие симптомы). Для подтверждения диагноза конкретного вируса необходимо применить не менее 3 специфических пар праймеров для обнаружения 3 вирусспецифических генов. Предпочтительно, чтобы эти гены-мишени располагались в вирусном геноме на максимально возможном расстоянии (включая противоположные концы).

Хотя в статье Кормана-Дростена описаны 3 праймера, эти праймеры покрывают лишь примерно половину генома вируса. Это еще один фактор, который снижает специфичность обнаружения интактной РНК вируса COVID-19 и увеличивает количество ложноположительных результатов тестов.

Следовательно, даже если мы получим три положительных сигнала (т.е. три пары праймеров дают 3 разных продукта амплификации) в образце, это не доказывает присутствие вируса. Лучшая конструкция праймера должна иметь концевые праймеры на обоих концах вирусного генома. Это связано с тем, что будет охвачен весь вирусный геном, и три положительных сигнала могут лучше различать полный (и, следовательно, потенциально заразный) вирусный геном от фрагментированного вирусного генома (без инфекционной активности). Чтобы сделать вывод об инфекционности вируса, нужно было включить ген Orf1, который кодирует основной фермент репликазы вирусов SARS-CoV (рис. 2). Позиционирование мишеней в той области вирусного генома, которая наиболее сильно и вариабельно транскрибируется, является еще одной слабостью протокола.

Kim et al. демонстрируют высоко вариабельную 3'-экспрессию субгеномной РНК в Sars-CoV-2 [23]. Эти РНК активно отслеживаются как сигнатуры для бессимптомных и неинфекционных пациентов [10]. Весьма сомнительно проводить скрининг популяции бессимптомных людей с помощью праймеров кПЦР, которые имеют праймер-димер из 6 пар оснований на 3 основных концах праймера (рисунок 3).
Видимо ВОЗ рекомендует эти праймеры. Мы протестировали все производные колебания бумаги Кормана-Дростена с помощью инструмента для создания димерных материалов компании Thermofisher [11]. Прямой праймер RdRp имеет гомологию 3 п.н. с Sarbeco E Reverse. При высоких концентрациях грунтовки этого достаточно, чтобы создать неточности.

Примечание: один из праймеров N идеально соответствует клиническому патогену (Pantoea), обнаруженному у пациентов с ослабленным иммунитетом. Обратный праймер также поражает Pantoea, но не в той же области (рис. 3).

Температуры реакции

2а) Температура плавления ДНК (> 92 °).

Адекватно рассмотрено в статье Кормана-Дростена.

2б) Температура амплификации ДНК.

Адекватно рассмотрено в статье Кормана-Дростена.

2c) Ошибочные данные GC и Tm

Температура отжига определяет, при какой температуре праймер прикрепляется / отсоединяется от целевой последовательности. Для эффективной и специфической амплификации содержание GC в праймерах должно соответствовать минимум 40% и максимуму 60% амплификации. Как указано в таблице 3, три праймера, описанные в статье Кормана-Дростена, не находятся в пределах нормального диапазона для содержания GC. Два праймера (RdRp_SARSr_F и RdRp_SARSr_R) имеют необычные и очень низкие GC-значения 28% -31% для всех возможных вариантов колебательных оснований, тогда как праймер E_Sarbeco_F имеет GC-значение 34,6% (Таблица 3 и вторая панель Таблицы 3).

Следует отметить, что содержание GC в значительной степени определяет связывание с его конкретной мишенью из-за трех водородных связей в спаривании оснований. Таким образом, чем ниже GC-содержание праймера, тем ниже его способность связываться с его конкретной последовательностью гена-мишени (то есть с геном, который необходимо обнаружить). Это означает, что для распознавания целевой последовательности мы должны выбрать температуру, которая как можно ближе к фактической температуре отжига (значение наилучшей практики), чтобы праймер не отслоился снова, и в то же время специально выбрать целевая последовательность.

Если значение Tm очень низкое, как это наблюдается для всех шатких вариантов обратных праймеров RdRp, праймеры могут неспецифично связываться с несколькими мишенями, снижая специфичность и увеличивая потенциальные ложноположительные результаты.

Температура отжига (Tm) является решающим фактором для определения специфичности / точности процедуры qPCR и важна для оценки точности протоколов qPCR. Рекомендация по передовой практике: оба праймера (прямой и обратный) должны иметь почти одинаковое значение, предпочтительно одинаковое значение.

Мы использовали свободно доступное программное обеспечение для создания праймеров Primer-BLAST [12, 25], чтобы оценить лучшие практические значения для всех праймеров, использованных в статье Кормана-Дростена (таблица 3). Мы попытались найти значение Tm, равное 60 ° C, при этом аналогичным образом искали максимально возможное значение GC% для всех праймеров. Максимальное различие Tm 2 ° C внутри пар праймеров считалось приемлемым. Тестируя пары праймеров, указанные в статье Кормана-Дростена, мы наблюдали разницу в 10 ° C по отношению к температуре отжига Tm для пары праймеров 1 (RdRp_SARSr_F и RdRp_SARSr_R). Это очень серьезная ошибка, которая делает протокол бесполезным в качестве специального диагностического инструмента.

Дополнительное тестирование показало, что только пара праймеров, разработанная для амплификации N-гена (N_Sarbeco_F и N_Sarbeco_R), достигла адекватного стандарта для работы в диагностическом тесте, поскольку она имеет достаточное содержание GC и разницу Tm между праймерами (N_Sarbeco_F и N_Sarbeco_R).) составляет 1,85 ° C (ниже критического максимума разницы в 2 ° C). Важно отметить, что это ген, который не тестировался в вирусных образцах (таблица 2) и не использовался в качестве подтверждающего теста. Помимо сильно изменяющихся температур плавления и вырожденных последовательностей в этих праймерах, существует еще один фактор, влияющий на специфичность процедуры: dNTP (0,4 мкМ) в 2 раза выше, чем рекомендовано для высокоспецифичной амплификации. В реакционную смесь также добавляют дополнительное количество сульфата магния. Эта процедура в сочетании с низкой температурой отжига может привести к неспецифическим усилениям. Если для количественной ПЦР требуется дополнительное количество магния, следует дополнительно изучить специфичность анализа.

Описанные здесь ошибки проектирования настолько серьезны, что маловероятно, что конкретная амплификация генетического материала SARS-CoV-2 будет происходить с использованием протокола статьи Кормана-Дростена.

Таблица 3: GC-содержание праймеров и зондов (адаптировано из статьи Кормана-Дростена; аберрации от оптимизированного GC-содержания выделены. На второй панели показан список всех значений передовой практики Primer-BLAST для всех праймеров и зондов, используемых в статья Кормана-Дростена, подготовленная профессором д-ром Ульрике Каммерер и ее командой

 

3. Количество циклов амплификации.

Следует отметить, что нигде в статье Кормана-Дростена нет упоминания о положительном или отрицательном результате теста или о том, что определяет положительный или отрицательный результат. Эти типы вирусологических диагностических тестов должны основываться на СОП, включая проверенное и фиксированное количество циклов ПЦР (значение Ct), после которых образец считается положительным или отрицательным. Максимально надежное значение Ct составляет 30 циклов. Выше Ct 35 циклов следует ожидать быстрого увеличения числа ложных срабатываний.

Биомолекулярные проверки

Чтобы определить, действительно ли амплифицированные продукты являются генами SARS-CoV-2, необходима биомолекулярная проверка амплифицированных продуктов ПЦР. Для диагностического теста эта проверка абсолютно необходима.

Валидацию продуктов ПЦР следует выполнять либо путем прогона продукта ПЦР в 1% геле агарозы с EtBr вместе с индикатором размера (линейкой ДНК или лестницей ДНК), чтобы можно было оценить размер продукта. Размер должен соответствовать расчетному размеру продукта амплификации. Но еще лучше секвенировать продукт амплификации. Последнее даст 100% уверенность в идентичности продукта амплификации. Без молекулярной проверки нельзя быть уверенным в идентичности амплифицированных продуктов ПЦР. Учитывая серьезные конструктивные ошибки, описанные ранее, амплифицированные продукты ПЦР могут быть любыми.

Также в статье Кормана-Дростена не упоминается случай небольших фрагментов КПЦР (около 100 п.н.): это может быть либо 1,5% гель агарозы, либо даже гель акриламида.

Тот факт, что эти продукты ПЦР не прошли валидацию на молекулярном уровне, является еще одной поразительной ошибкой протокола, делающей любой тест, основанный на нем, бесполезным в качестве специального диагностического инструмента для идентификации вируса SARS-CoV-2.

Описанный протокол, к сожалению, очень расплывчат и ошибочен по своей конструкции, так что можно использовать десятки различных направлений. Кажется, что нет ни стандартизации, ни СОП, поэтому неясно, как можно реализовать этот тест.

7. Последствия ошибок, описанных в пунктах 1-5: ложноположительные результаты.

Тест ОТ-ПЦР, описанный в статье Кормана-Дростена, содержит так много ошибок молекулярно-биологического дизайна (см. 1-5), что невозможно получить однозначные результаты. Неизбежно, что этот тест вызовет огромное количество так называемых «ложных срабатываний».
Определение ложноположительных результатов - это отрицательный образец, который изначально дает положительный результат, но становится отрицательным после повторного тестирования с помощью того же теста.
Ложноположительные результаты - это ошибочные положительные результаты теста, то есть отрицательные образцы, которые дают положительный результат. И это действительно то, что содержится в статье Кормана-Дростена.
На странице 6 рукописного PDF-документа авторы демонстрируют, что даже в хорошо контролируемых лабораторных условиях этот тест дает значительный процент ложных срабатываний:

«В четырех отдельных тестовых реакциях наблюдалась слабая начальная реактивность, однако они были отрицательными при повторном тестировании с помощью того же теста. Эти сигналы не были связаны с каким-либо конкретным вирусом, и для каждого вируса, с которым возникла исходная положительная реактивность, были другие образцы, которые содержали тот же вирус в более высокой концентрации, но не дали положительного результата теста. Учитывая результаты обширной технической аттестации, описанной выше, был сделан вывод, что эта начальная реактивность не была связана с химической нестабильностью ПЦР-зондов в реальном времени и, скорее всего, с проблемами, вызванными быстрым внедрением новых диагностических тестов и средств контроля во время этой оценки. исследование." [1]

Первое предложение этого отрывка является четким доказательством того, что тест ПЦР, описанный в статье Кормана-Дростена, дает ложноположительные результаты. Даже в хорошо контролируемых условиях современной лаборатории Шарите 4 из 310 первичных тестов по определению являются ложноположительными. Четыре отрицательных образца сначала дали положительный результат, а затем дали отрицательный результат при повторном тестировании. Это классический пример ложного срабатывания.
В этом случае авторы не идентифицируют их как ложные срабатывания, что является интеллектуально нечестным.

Еще одно показательное наблюдение в приведенном выше отрывке состоит в том, что авторы объясняют ложные срабатывания «устранением проблем, вызванных быстрым внедрением новых диагностических тестов». Представьте себе лаборатории, которые должны внедрить тест без всей необходимой информации, обычно описываемой в СОП.

Авторы как редакторы.

Последний пункт вызывает серьезную озабоченность. Оказывается, два автора статьи Кормана-Дростена, Кристиан Дростен и Шанталь Реускен, также являются членами редколлегии этого журнала [19]. Следовательно, существует серьезный конфликт интересов, который усиливает подозрения, что статья не рецензировалась.
Создается впечатление, что быстрая публикация стала возможной просто потому, что авторы также входили в состав редакционной коллегии Eurosurveillance. Эта практика классифицируется как компрометация научной честности.

В свете нашего повторного изучения протокола тестирования для выявления SARS-CoV-2, описанного в документе Кормана-Дростена, мы выявили ошибки и внутренние ошибки, которые делают бесполезным тест SARS-CoV-2 PCR.

ВЫВОД

Решение о том, какие протоколы испытаний опубликовать и сделать широко доступными, находится непосредственно в руках Евронаблюдения. Решение признать ошибки, очевидные в статье Кормана-Дростена, позволяет значительно минимизировать человеческие затраты и страдания в будущем.

Разве не в интересах Евронаблюдения отозвать этот документ? Наш вывод ясен. Перед лицом всех описанных здесь огромных недостатков и ошибок проектирования протоколов ПЦР мы делаем вывод: в рамках научной честности и ответственности не остается большого выбора.

ССЫЛКИ

[1] Корман Виктор М., Ландт Ольферт, Кайзер Марко, Моленкамп Рихард, Мейер Адам, Чу Даниэль К.В., Блейкер Тобиас, Брюнинк Себастьян, Шнайдер Джулия, Шмидт Мари Луиза, Малдерс Дафна Дж. Дж. К., Хаагманс Барт Л., ван дер Вир Бас, ван ден Бринк Шарон, Вийсман Лиза, Годерски Габриэль, Рометт Жан-Луи, Эллис Джоанна, Замбон Мария, Пейрис Малик, Гуссенс Херман, Реускен Шанталь, Купманс Марион П.Г., Дростен Кристиан. Обнаружение нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. Euro Surveill. 2020; 25 (3): pii = 2000045. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045

[2] Электронная переписка между доктором Питером Боргером и доктором Адамом Мейджером: дополнительные материалы

[3] Джафаар и др., Корреляция между 3790 образцами с положительными результатами количественной полимеразной цепной реакции и положительными культурами клеток, включая 1941 изолятов коронавируса 2 с тяжелым острым респираторным синдромом. https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa1491/5912603

[4] BBC, 21 января 2020 г.: https://www.bbc.com/news/world-asia-china-51185836;
Архив: https://archive.is/0qRmZ

[5] Google Analytics - COVID19-смерти по всему миру:
https://bit.ly/3fndemJ   Архив: https://archive.is/PpqEE

[6] Лабораторные испытания Технического центра экстренного реагирования на COVID-19, NIVD при Центре контроля заболеваний Китая, 15 марта 2020 г.: http://www.chinacdc.cn/en/COVID19/202003/P020200323390321297894.pdf

[7] Справочник по технологиям ПЦР в реальном времени: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/real-time-pcr-
handbook.pdf

Нолан Т., Хаггетт Дж., Санчес Э. Хорошее практическое руководство по применению количественной ПЦР (qPCR) Первое издание 2013 г.

[8] Трестан Пиллонел и др., Письмо редактору: обнаружение SARS-CoV-2 с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7268274/

[9] Куркела, Сату и Дэвид В.Г. Браун. «Молекулярно-диагностические методы». Медицина 38.10
(2009): 535-540.

[10] Вольфель и др., Вирусологическая оценка госпитализированных пациентов с COVID-2019
https://www.nature.com/articles/s41586-020-2196-x

[11] Веб-инструмент Thermofischer Primer Dimer: https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library /thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html

Дополнительные материалы:
[12] Primer-BLAST, NCBI - Национальный центр биотехнологической информации: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

[13] Марра М.А., Стивен Дж.М.Дж., Кэролайн Р.А., Роберт А.Х., Анджела Б.В. и др. (2003) Наука. Последовательность генома коронавируса, ассоциированного с SARS. Наука 300 (5624): 1399-1404.

[14] Изолят коронавируса 2 тяжелого острого респираторного синдрома Ухань-Ху-1, полный
геном: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MN908947

[15] Боргер П. Ожидался коронавирус, похожий на атипичную пневмонию, но ничего не было сделано для подготовки. Am J Biomed Sci Res 2020. https://biomedgrid.com/pdf/AJBSR.MS.ID.001312.pdf
https://www.researchgate.net/publication/341120750_A_SARS-ike_Coronavirus_was_Expected_but_nothing_was_done_to_be_Prepared;
Архив: https://archive.is/i76Hu

[16] Процесс оценки / проверки документов Евронадзора: https://www.eurosurveillance.org/evaluation

[17] Официальная рекомендация протокола Кормана-Дростена и рукопись ВОЗ, опубликованные 13 января 2020 года как версия документа 1.0:
https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/wuhan-virus -assay-
v1991527e5122341d99287a1b17c111902.pdf; архив: https://bit.ly/3m3jXVH

[18] Официальная рекомендация ВОЗ по протоколу RT-qPCR Кормана / Дростена, которая
непосредственно вытекает из публикации Eurosurveillance, версия документа 2-1, опубликованной
17 января 2020 г.: https://www.who.int/ docs / default-source / coronaviruse / protocol-v2-
1.pdf? sfvrsn = a9ef618c_2

[19] Редакционный совет Eurosurveillance, 2020: https://www.eurosurveillance.org/upload/site-
assets / imgs / 2020-09-Редакционное% 20Board% 20PDF.pdf;
Архив: https://bit.ly/2TqXBjX

[20] Инструкции по применению LightMix SarbecoV E-gene plus EAV Control, TIB-Molbiol & Roche
Molecular Solutions, 11 января 2020 г.: https://www.roche-as.es/lm_pdf/MDx_40-0776_96_Sarbeco-E-
gene_V200204_09164154001 (1).pdf
Архив, отметка времени - 11 января 2020 г.: https://archive.is/Vulo5;
Архив: https://bit.ly/3fm9bXH

[21] Кристиан Дростен и Виктор Корман, ответственные за вирусную диагностику в Labor Berlin:
https://www.laborberlin.com/fachbereiche/virologie/
Архив: https://archive.is/CDEUG

[22] Том Джефферсон, Элизабет Спенсер, Джон Брасси, Карл Хенеган Вирусные культуры для оценки
инфекционности COVID- 19. Регулярный обзор. Систематический обзор doi:
https://doi.org/10.1101/2020.08.04.20167932 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.08.04.20167932v4

[23] Ким и др., Архитектура транскриптома SARS-CoV-2:
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867420304062

[24] Ответ ECDC д-ру Питеру Боргеру, 18 ноября 2020 г.:
Дополнительные материалы

[25] Проф. Д-р Ульрике Каммерер и команда, исследование и таблица Primer-BLAST:
дополнительные материалы

Дополнительная литература:

Описание RT-PCR RKI Germany, на странице 10 этой ссылки:
https://www.rki.de/DE/Content/Gesundheitsmonitoring/Gesundheitsberichterstattung/GBE
DownloadsJ /
JoHM_S5_2020_Studienprotokoll_CORONA_MONITORING_lokal.pdf

Авторы:

1) Д-р Питер Боргер (магистр, доктор философии), молекулярная генетика, научный сотрудник W + W, Лёррах, Германия

2) Раджеш Кумар Малхотра (художник, псевдоним: Бобби Раджеш Малхотра), бывший 3D-художник / научные визуализации в CeMM - Центре молекулярной медицины Австрийской академии наук (2019-2020), Университет прикладных искусств - Департамент цифровых искусств Вены, Австрия

3) Д-р Майкл Йидон, BS (с отличием) Biochem Tox U Surrey, PhD Pharmacology U Surrey. Управляющий директор Yeadon Consulting Ltd, бывший главный научный сотрудник Pfizer, Великобритания

4) Д-р Клэр Крейг, Массачусетс, (Кантаб), BM, BCh (Oxon), FRCPath, Соединенное Королевство

5) Кевин МакКернан, BS Университет Эмори, главный научный сотрудник, основатель компании Medical Genomics, спроектировал конвейер секвенирования в WIBR / MIT для проекта «Геном человека», изобрел и разработал секвенатор SOLiD, получил патенты, связанные с ПЦР, выделением и секвенированием ДНК, США

6) Профессор доктор Клаус Штегер, отделение урологии, детской урологии и андрологии, молекулярной андрологии, Центр биомедицинских исследований Университета Юстуса Либиха, Гиссен, Германия

7) Д-р Пол МакШихи (бакалавр, доктор философии), биохимик и промышленный фармаколог, Леррах, Германия

8) Доктор Лидия Ангелова, магистр биологии, кандидат микробиологии, бывший научный сотрудник Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID), Мэриленд, США.

9) Д-р Фабио Франки, бывший врач Dirigente Medico (MD) в отделении инфекционных болезней, специализирующийся на «Инфекционных заболеваниях» и «Гигиене и профилактической медицине», Società Scientifica per il Principio di Precauzione (SSPP), Италия.

Д-р Марджолейн Дусбург-ван Клеффенс (MSc, PhD), специалист в области лабораторной медицины (клиническая химия), Maasziekenhuis Pantein, Beugen, Нидерланды

Проф. Д-р Ульрике Каммерер, специалист в области вирусологии / иммунологии / биологии человека / клеточной биологии, Университетская клиника Вюрцбурга, Германия

Вклад авторов:

ПБ: Спланировал и провел анализ и исследования, концептуализируя рукопись.

BRM: Спланировал и провел исследование, концептуализируя рисунки и рукопись.

Саджи Н Хамид, специалист по экологической информатике, Университет Айзу, Цуруга, Икки-мати, Айзувакамацу-си, Фукусима, Япония

Дополнение

Обновление 2.12.2020:

Вклад автора Д-р Майкл Йидон изменен на:
Вычитка анализов и исследований.

Принадлежность автора Кевин Макернан изменен на:
Medicinal Genomics.

Этот подробный отчет о проверке был официально представлен в редакцию Eurosurveillance 27 ноября 2020 года через портал для подачи материалов. К настоящему отчету о проверке прилагается письмо с просьбой об отзыве, подписанное всеми основными и соавторами. Имя и фамилия - это первый и второй основные авторы. Все промежуточные имена являются соавторами.

Внешняя экспертная оценка теста RTPCR для обнаружения SARS-CoV-2 выявляет 10 основных научных недостатков на молекулярном и методологическом уровне: последствия ложноположительных результатов.

Питер Боргер (1), Бобби Раджеш Малхотра (2), Майкл Йидон (3), Клэр Крейг (4), Кевин МакКернан (5), Клаус Стегер (6), Пол МакШихи (7), Лидия Ангелова (8), Фабио Франчи (9), Томас Биндер (10), Хенрик Ульрих (11), Макото Охаши (12), Стефано Скольо (13), Марджолейн Дусбург-ван Клеффенс (14), Доротея Гилберт (15), Райнер Клемент (16), Рут Шруфер (17), бербер В. Пиксма (18), Ян Бонте (19), Бруно Х. Далле Карбонар (20), Кевин П. Корбетт (21), Ульрике Каммерер (22)

АННОТАЦИЯ

В публикации под названием «Обнаружение нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV) с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени» (Eurosurveillance 25 (8) 2020) авторы представляют рабочий процесс диагностики и протокол ОТ-КПЦР для обнаружения и диагностики 2019-nCoV. (теперь известный как SARS-CoV-2), который, по их утверждениям, прошел валидацию, а также является надежной диагностической методологией для использования в лабораторных условиях общественного здравоохранения.

В свете всех последствий, вытекающих из этой публикации для обществ во всем мире, группа независимых исследователей выполнила поэтапный обзор вышеупомянутой публикации, в котором 1) все компоненты представленного дизайна теста были перекрестно проверены, 2) Рекомендации протокола RT-qPCR были оценены с учетом надлежащей лабораторной практики, а 3) параметры были изучены по соответствующей научной литературе, охватывающей эту область.

Опубликованный протокол RT-qPCR для обнаружения и диагностики 2019-nCoV и рукопись страдают многочисленными техническими и научными ошибками, включая недостаточный дизайн праймеров, проблемный и недостаточный протокол RT-qPCR и отсутствие точной проверки теста. Ни представленный тест, ни сама рукопись не отвечают требованиям для приемлемой научной публикации. Далее не упоминаются серьезные конфликты интересов авторов. Наконец, очень короткий промежуток времени между подачей и принятием публикации (24 часа) означает, что систематический процесс рецензирования здесь либо не проводился, либо имел проблематичное низкое качество. Мы предоставляем неопровержимые доказательства ряда научных несоответствий, ошибок и недостатков.