Что важно при разработке теста RT-PCR и количественного теста RT-qPCR, описанных в публикации Кормана-Дростена?

1. Праймеры и зонды:

a) концентрация праймеров и зондов должна быть оптимального диапазона
(100-200 нМ)
b) должна быть специфичной для целевого гена, который вы хотите амплифицировать
c) должна иметь оптимальный процент содержания GC относительно общего количества азотистых оснований (минимум 40%, максимум 60%)
г) для диагностики вирусов минимум 3 пары праймеров должны обнаруживать 3 вирусных гена (желательно как можно дальше друг от друга в вирусном геноме)

2. Температура, при которой происходят все реакции:

а) температура плавления ДНК (> 92 °)
б) температура амплификации ДНК (специфичная для TaqPol)
в) Tm; температура отжига (температура, при которой праймеры и зонды достигают целевого связывания / отсоединения, не должна превышать 2 ° C на пару праймеров). Tm сильно зависит от содержания GC в праймерах.

3. Количество циклов амплификации (менее 35, предпочтительно 25-30 циклов);

В случае обнаружения вируса более 35 циклов обнаруживают только сигналы, которые не коррелируют с инфекционным вирусом, как определено путем выделения в культуре клеток [обзор в 2]; если кто-то получил положительный результат с помощью ПЦР при использовании порога 35 циклов или выше (как в большинстве лабораторий в Европе и США), вероятность того, что этот человек действительно инфицирован, составляет менее 3%, вероятность того, что указанный результат является ложноположительным - 97% [обзор в 3]

Молекулярно-биологические подтверждения; амплифицированные продукты ПЦР должны быть проверены либо путем прогона продуктов в геле с линейкой ДНК, либо путем прямого секвенирования ДНК.

Следует указать положительный и отрицательный контроли для подтверждения / опровержения обнаружения конкретного вируса.

Должна быть доступна Стандартная операционная процедура (СОП).

В СОП недвусмысленно указаны вышеуказанные параметры, поэтому все лаборатории могут установить одинаковые условия испытаний. Наличие утвержденной универсальной СОП очень важно, поскольку она позволяет сравнивать данные внутри стран и между странами.

Незначительные проблемы с бумагой CORMAN-DROSTEN

1. В таблице 1 статьи Кормана-Дростена указаны различные сокращения - указано «нМ», а «нм» нет. Далее, что касается правильной номенклатуры, нм означает «нанометр», поэтому здесь нм следует читать нМ.

2. По общему мнению, генетические последовательности всегда должны записываться в направлении 5'-3 ', включая обратные праймеры. Очень необычно выполнять выравнивание с обратной комплементарной записью последовательности праймера, как это сделали авторы на рис. 2 статьи Кормана-Дростена. Здесь, кроме того, база колебания помечена как «y» без описания оснований, которые обозначает Y.

3. Две вводящие в заблуждение ошибки в работе Кормана-Дростена заключаются в том, что их таблица 1 не включает Tm-значения (значения температуры отжига), а также не показывает GC-значения (количество G и C в последовательностях как% -значение от всего баз).

ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ С БУМАГОЙ КОРМАН-ДРОСТЕН

ЗАДНИЙ ФОН

Авторы представляют предысторию своей научной работы следующим образом: «Продолжающаяся вспышка недавно возникшего нового коронавируса (2019-nCoV) представляет собой проблему для лабораторий общественного здравоохранения, поскольку изоляты вируса недоступны, в то время как появляется все больше свидетельств того, что вспышка более распространена, чем изначально думали, а международное распространение через путешественников уже происходит».

По данным BBC News [4] и Google Statistics [5], 21 января 2020 года во всем мире погибло 6 человек - в день отправки рукописи. Почему авторы решили, что это вызов для лабораторий общественного здравоохранения, хотя в то время не было существенных доказательств того, что вспышка была более распространенной, чем предполагалось изначально?

В качестве цели авторы заявили о разработке и внедрении надежной диагностической методологии для использования в лабораторных условиях общественного здравоохранения без наличия вирусного материала. Кроме того, они признают, что «Настоящее исследование демонстрирует огромный потенциал реагирования, достигнутый за счет координации академических и государственных лабораторий в национальных и европейских исследовательских сетях».

Б) МЕТОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ

Праймер и конструкция зонда

1a) Ошибочные концентрации праймера

Протоколы надежных и точных ПЦР-тестов обычно разрабатываются с использованием от 100 до 200 нМ на праймер [7]. В статье Кормана-Дростен мы наблюдаем необычно высокие и разные концентрации праймеров для нескольких праймеров (таблица 1). Для пар праймеров RdRp_SARSr-F и RdRp_SARSr-R описаны 600 нМ и 800 нМ, соответственно. Точно так же для набора праймеров N_Sarbeco_F и N_Sarbeco_R они рекомендуют 600 нМ и 800 нМ соответственно [1].

Должно быть ясно, что эти концентрации слишком высоки, чтобы быть оптимальными для конкретных амплификаций генов-мишеней. В этом протоколе нет конкретной причины использовать эти чрезвычайно высокие концентрации праймеров. Скорее, эти концентрации приводят к усилению неспецифического связывания и амплификации продукта ПЦР.

Таблица 1: Праймеры и зонды (адаптировано из статьи Кормана-Дростена; ошибочные концентрации праймеров выделены)

 

1b) Неуказанные («шаткие») последовательности праймеров и зондов.

Для получения воспроизводимых и сопоставимых результатов важно четко определить пары праймеров. В статье Кормана-Дростена мы наблюдали шесть неуказанных положений, обозначенных буквами R, W, M и S (Таблица 2). Буква W означает, что в этой позиции может быть либо A, либо T; R означает, что может быть либо G, либо A; M указывает, что позиция может быть A или C; буква S указывает на то, что на этой позиции может быть буква G или C.

Такое большое количество вариантов не только необычно, но и сбивает с толку лаборатории. Эти шесть неуказанных положений могут легко привести к созданию нескольких различных альтернативных последовательностей праймеров, которые не относятся к SARS-CoV-2 (2 различных праймера RdRp_SARSr_F + 8 различных зондов RdRp_SARS_P1 + 4 различных RdRp_SARSr_R).
Изменения конструкции неизбежно приведут к результатам, даже не связанным с SARS CoV-2. Следовательно, сбивающее с толку неспецифическое описание в статье Кормана-Дростена не подходит в качестве стандартного рабочего протокола. Эти неуказанные позиции должны были быть разработаны недвусмысленно.

Эти шаткие последовательности уже вызвали беспокойство в этой области и привели к письму в редакцию, написанному Pillonel et al. [8] относительно явных ошибок в описанных последовательностях. Эти ошибки очевидны в Corman et al. добавка.

Таблица 2: Праймеры и зонды (адаптировано из статьи Кормана-Дростена; неуказанные («шаткие») нуклеотиды в праймерах выделены)

Протокол ВОЗ (рис. 1), который непосредственно заимствован из статьи Кормана-Дростена, заключает, что для подтверждения наличия SARS-CoV-2 необходимо идентифицировать два контрольных гена (гены E и RdRp). в пробирке. Следует отметить, что ген RdPd имеет одно неопределенное положение («шаткое») в прямом праймере (R = G / A), два неопределенных положения в обратном праймере (R = G / A; S = G / C) и он имеет три неопределенных положения в датчике RdRp (W = A / T; R = G / A; M = A / C).
Таким образом, для гена RdPd можно синтезировать два разных прямых праймера, четыре разных обратных праймера и восемь различных зондов. Всего существует 64 возможных комбинации праймеров и зондов!

В документе Кормана-Дростена также указывается третий ген, который, согласно протоколу ВОЗ, не прошел дальнейшей валидации и не был признан необходимым:

«Следует отметить, что анализ N-гена также показал хорошие результаты, но не подвергался дальнейшей интенсивной проверке, поскольку был немного менее чувствителен».

Это было досадным упущением, так как лучше всего было бы использовать ПЦР всех трех генов в качестве подтверждающих анализов, и это привело бы к почти достаточному протоколу диагностического инструмента обнаружения вирусной РНК. Три подтверждающих этапа анализа, по крайней мере, минимизируют ошибки и неопределенности на каждом этапе складывания в отношении «шатких» пятен.
(Тем не менее, протокол все равно не соответствовал бы любой «хорошей лабораторной практике», если учесть все другие ошибки проектирования).

В его нынешнем виде, к сожалению, анализ N-гена не предлагается ни в рекомендации ВОЗ (рис. 1) в качестве обязательного и важного третьего подтверждающего шага, ни в документе Кормана-Дростена как важный необязательный аргумент «для рутинного рабочего процесса». (Таблица 2).

Следовательно, почти во всех испытательных процедурах во всем мире использовалось только 2 совпадения праймеров вместо всех трех. Такой надзор делает весь протокол испытаний бесполезным с точки зрения предоставления точных результатов испытаний, имеющих реальное значение в продолжающейся пандемии.

Рисунок 1: Подтверждающий анализ N-гена не подчеркивается как необходимый третий шаг в официальной рекомендации ВОЗ по протоколу Дростена-Кормана, приведенной ниже [8], и не требуется как решающий шаг для повышения точности теста в публикации Eurosurveillance.

1c) Ошибочное содержание GC (обсуждается в 2c вместе с температурой отжига (Tm))

1г) Обнаружение вирусных генов

ОТ-ПЦР не рекомендуется для первичной диагностики инфекции. Вот почему тест ОТ-ПЦР, используемый в повседневной клинической практике для выявления COVID-19, не рекомендуется для диагностики COVID-19 на нормативной основе.

« Клиницисты должны осознавать повышенную точность и скорость молекулярных диагностических методов для диагностики инфекций, но также понимать их ограничения. Лабораторные результаты всегда следует интерпретировать в контексте клинической картины пациента, и для получения надежных результатов необходимы соответствующее место, качество и время сбора образцов ». [9]

Однако его можно использовать, чтобы помочь врачу в дифференциальной диагностике, когда он или она должен различать различные инфекции легких (грипп, Covid-19 и SARS имеют очень похожие симптомы). Для подтверждения диагноза конкретного вируса необходимо применить не менее 3 специфических пар праймеров для обнаружения 3 вирусспецифических генов. Предпочтительно, чтобы эти гены-мишени располагались в вирусном геноме на максимально возможном расстоянии (включая противоположные концы).

Хотя в статье Кормана-Дростена описаны 3 праймера, эти праймеры покрывают лишь примерно половину генома вируса. Это еще один фактор, который снижает специфичность обнаружения интактной РНК вируса COVID-19 и увеличивает количество ложноположительных результатов тестов.

Следовательно, даже если мы получим три положительных сигнала (т.е. три пары праймеров дают 3 разных продукта амплификации) в образце, это не доказывает присутствие вируса. Лучшая конструкция праймера должна иметь концевые праймеры на обоих концах вирусного генома. Это связано с тем, что будет охвачен весь вирусный геном, и три положительных сигнала могут лучше различать полный (и, следовательно, потенциально заразный) вирусный геном от фрагментированного вирусного генома (без инфекционной активности). Чтобы сделать вывод об инфекционности вируса, нужно было включить ген Orf1, который кодирует основной фермент репликазы вирусов SARS-CoV (рис. 2). Позиционирование мишеней в той области вирусного генома, которая наиболее сильно и вариабельно транскрибируется, является еще одной слабостью протокола.

Kim et al. демонстрируют высоко вариабельную 3'-экспрессию субгеномной РНК в Sars-CoV-2 [23]. Эти РНК активно отслеживаются как сигнатуры для бессимптомных и неинфекционных пациентов [10]. Весьма сомнительно проводить скрининг популяции бессимптомных людей с помощью праймеров кПЦР, которые имеют праймер-димер из 6 пар оснований на 3 основных концах праймера (рисунок 3).
Видимо ВОЗ рекомендует эти праймеры. Мы протестировали все производные колебания бумаги Кормана-Дростена с помощью инструмента для создания димерных материалов компании Thermofisher [11]. Прямой праймер RdRp имеет гомологию 3 п.н. с Sarbeco E Reverse. При высоких концентрациях грунтовки этого достаточно, чтобы создать неточности.

Примечание: один из праймеров N идеально соответствует клиническому патогену (Pantoea), обнаруженному у пациентов с ослабленным иммунитетом. Обратный праймер также поражает Pantoea, но не в той же области (рис. 3).