И fraxf как методическая основа проведения неонатального скрининга.

СМБ – одна из наиболее распространённых наследственных болезней. Так, в Великобритании ежегодно выявляется около 200 случаев СМБ у детей, что в сравнении с данными по синдрому Дауна (порядка 1000 случаев в год) говорит о высокой популяционной частоте СМБ. Поскольку на сегодняшний день не описано ни одного спорадического случая СМБ, вызванного экспансией тринуклеотидного повтора, очевидно, что расширенные программы скрининга позволят значительно снизить частоту этого заболевания. При определении стратегии скрининга на СМБ необходимо опираться на опыт и учитывать ошибки зарубежных стран, в которых уже были предприняты подобные попытки.

Наиболее продолжительная и полная программа, направленная на снижение популяционной частоты СМБ, существует в Новом Уэллсе (Австралия). Начиная с 1994 г. в Новом Уэллсе проводится скрининг детей с отставанием в умственном развитии. Клинические, цитогенетические и молекулярно-генетические исследования, проведённые для 14225 таких детей, позволили выявить 253 больных с СМБ, что составило 1.8% от общего числа обследованных.

Последующий каскадный скрининг, подразумевающий обследование всех доступных членов семей, позволил за 10 лет снизить частоту рождения мальчиков с СМБ в 2.5 раза – с 2.5 до 1:10000 (рис.37). Опыт Австралии подтверждает эффективность скрининга детей с отставанием в умственном развитии на синдром Мартина-Белл и последующего каскадного скрининга в семьях. Однако, несмотря на то, что рождаемость мальчиков с СМБ после применения каскадного скрининга снизилась, она, тем не менее, остаётся довольно высокой – 1:10000. Это говорит о необходимости проведения расширенных, общепопуляционных программ скрининга. Принципиальных стратегий такого скрининга две: 1) выявление всех женщин-носителей СМБ и 2) всеобщий неонатальный скрининг мальчиков.

Пробные программы по выявлению женщин-носителей СМБ в общей популяции проводились во многих странах Европы и в США, однако нигде такие работы не переросли за рамки исследовательских и не приобрели статуса общенациональных. Один этот факт свидетельствует о том, что при существующих методах выявления носителей такой скрининг остаётся экономически неоправданным. Существуют и другие затруднения - технические, этические и др., связанные с такой стратегией скрининга. Большая часть авторов проводит расчёты исходя из того, что основным методом выявления носительниц премутаций и полных мутаций должна быть полимеразная цепная реакция. Однако, по данным литературы, не менее чем у 30% женщин число триплетов CGG-повтора на обеих Х-хромосомах оказывается идентичным или близким. В исследовании, проведенном нами для 322 женщин, количество гомозигот по повтору CCG составило 40% (частоты аллелей показаны на рис.38), что не позволяет ограничиться использованием только метода ПЦР. В таких случаях должен использоваться метод гибридизации по Саузерну, неприменимость которого в программах расширенного скрининга очевидна. Кроме того, при частоте рождаемости мальчиков с СМБ, равной 1:10000, которой можно добиться применением скрининга умственно отсталых детей и последующего каскадного скрининга в семьях, для выявления одного плода с СМБ потребуется как минимум 80 инвазивных пренатальных вмешательств, которые представляют собой дорогие процедуры, осложнённые организацонными проблемами, не говоря об эмоциональном воздействии на женщину и о риске для жизнеспособности плода.

Ещё одна сложность связана с недостатком наших знаний о риске экспансии аллелей с той или иной длиной CGG-повтора у женщин в общей популяции, поскольку процесс экспансии традиционно изучался на родственниках уже выявленных больных с СМБ. Для оценки риска нестабильности повтора необходимо исследовать значительное число его характеристик и свойств его хромосомного окружения, таких, как количество и расположение вставок AGG, длина фланкирующих микросателлитных маркёров, свойства внутригенных однонуклеотидных полиморфизмов в FMR 1 и т.п., что выводит исследование за рамки скрининга по всем параметрам.

Что же касается стратегии скрининга новорожденных мальчиков, она, даже при применении традиционных методов выявления СМБ, требует значительно меньших затрат, чем в первом случае. Отпадает необходимость создания специальных служб, занимающихся сбором материала для анализов, кроме того, диагностика СМБ у лиц мужского пола осуществляется значительно проще, а результаты исследования ДНК в большинстве случаев интерпретируются абсолютно однозначно. Очевидно, сочетание неонатального скрининга мальчиков с каскадным скринингом в семьях, эффективность которого уже была практически доказана, является в настоящее время наиболее безопасной и экономически целесообразной стратегией общепопуляционного скрининга СМБ.

Наиболее привлекательным для скрининга больших групп лиц мужского пола следует признать анализ метилирования с помощью ПЦР, сочетающий в себе технологическую простоту наряду с возможностью использования весьма незначительных количеств ДНК. Разработанный нами протокол МЧ-ПЦР, позволяющий определять состояние метилирования CpG-островков трёх ломких хромосомных участков Х-хромосомы – FRAXA, FRAXE и FRAXF – в одной пробирке, позволяет эффективно выявлять не только новорожденных с СМБ, УО FRAXE, и полными мутациями FRAXF, но и некоторые численные аномалии половых хромосом, часть из которых может приводить к умственной отсталости различной степени тяжести. В частности, анализ метилирования FMR 1 позволяет выявлять дополнительные Х-хромосомы у лиц мужского пола. Речь идёт о мужчинах с кариотипом 47,XXY; 49,XXXXY; 48,XXXY; 46,XX и о различных вариантах мозаицизма (рис.39). Кариотип 49,XXXXY ассоциирован с тяжёлой умственной отсталостью. Среди больных с синдромом Клайнфельтера, 47,XXY, и вариантом синдрома Клайнфельтера, 48,XXXY, частота умственной отсталости также превышает среднепопуляционные показатели. Выявление таких новорожденных при неонатальном скрининге может ставить вопрос о проведении ранней коррекции и разработке терапевтических подходов.

МЧ-ПЦР как метод неонатального скрининга позволяет выявлять генетические аномалии приблизительно у 1 на 500-800 обследованных новорождённых мужского пола. Большинство этих аномалий сопровождается различными фенотипами умственной отсталости и требует ранней коррекции, а также обследования родственников с целью дальнейшего эффективного планирования семьи (каскадный скрининг в случае СМБ). Поскольку в целом фенотип таких больных при рождении обычно не отличается от нормального, ранняя диагностика возможна только благодаря молекулярно-генетическим методам скрининга.

 

Литература.

1. Введение в молекулярную медицину: под ред. Пальцева М.А. Москва, «Медицина», 2004 г.

2. Cagnoli Claudia, Chiara Michielotto, Tohru Matsuura, Tetsuo Ashizawa, Russell L. Margolis, Susan E. Holmes, Cinzia Gellera, Nicola Migone, and Alfredo Brusco //Detection of Large Pathogenic Expansions in FRDA1, SCA10, and SCA12 Genes Using a Simple Fluorescent Repeat-Primed PCR Assay// J. Mol. Diagn., 2004; 6: 96 - 100.

3. Carson NL //Analysis of repetitive regions in myotonic dystrophy type 1 and 2//
Curr Protoc Hum Genet, 2009; Chapter 9: Unit 9.6.

4. Joensuu T, Kuronen M, Alakurtti K, Tegelberg S, Hakala P, Aalto A, Huopaniemi L, Aula N, Michellucci R, Eriksson K, Lehesjoki AE// Cystatin B: mutation detection, alternative splicing and expression in progressive myclonus epilepsy of Unverricht-Lundborg type (EPM1) patients// Eur J Hum Genet 2007 15(2):185-193.

5. Strelnikov V, M Nemtsova, G Chesnokova, N Kuleshov, and D Zaletayev //A simple multiplex FRAXA, FRAXE, and FRAXF PCR assay convenient for wide screening programs//
Hum Mutat, 1999; 13(2): 166-169.