Лабораторная диагностика болезней экспансии некодирующих микросателлитных повторов.

Важным отличием этой группы заболеваний от болезней экспансии кодирующих микросателлитных повторов является значительное увеличение длин повторяющихся последовательностей, сопровождающееся множественной дисфункцией или дегенерацией различных тканей. Клинические проявления каждого заболевания вариабельны, возможно, вследствие выраженной соматической гетерогенности мутаций. Некодирующие микросателлитные повторы, нестабильность которых приводит к болезням экспансии, различаются как нуклеотидным составом повторяющихся единиц (таблица 3), так и расположением относительно кодирующих и регуляторных элементов генов, что обусловливает уникальность механизмов патогенеза и особенности лабораторной диагностики каждого заболевания.

5.1. Прогрессирующая миоклонус-эпилепсия.

Прогрессирующая миоклонус-эпилепсия (ПМЭ) – аутосомно-рецессивное дегенеративное заболевание нервной системы, характеризующееся сочетанием миоклонических гиперкинезов с эпилептическими приступами и хроническим прогрессирующим течением, ведущим к церебеллярной атаксии. Причиной ПМЭ являются мутации в гене цистатина В (CSTB), кодирующим ингибитор цистеиновых протеиназ. Подавляющее большинство мутаций в этом гене представляют собой крупные экспансии двенадцатинуклеотидного повтора CCCCGCCCCGCG, расположенного в промоторной области CSTB. Патологическая экспансия повтора приводит к нарушению синтеза соответствующей мРНК и белкового продукта. Из нескольких возможных гипотез о механизмах влияния экспансии на синтез мРНК – нарушение пространственной организации промоторных элементов, гиперметилирование, изменение структуры хроматина и избыточное связывание репрессоров транскрипции – наибольшее подтверждение получила первая, согласно которой экспансия повтора увеличивает расстояние от сайта связывания активатора транскрипции до точки инициации транскрипции и ограничивает пространственные взаимодействия активатора с другими элементами транскрипционного комплекса.

В нормальной популяции наиболее распространены аллели, содержащие 2-3 копии повтора CCCCGCCCCGCG. У клинически здоровых родственников больных определяется до 17 повторов, которые являются «премутационными» и обнаруживают нестабильность при передаче потомству; у больных число копий достигает 75. Даже при максимальном количестве повторов длина патологического аллеля не превышает 1000 п.н., что позволяет детектировать экспансию стандартными методами ПЦР (рис. 6).

Незначительная протяженность кодирующих участков гена CSTB позволяет проводить детекцию всех возможных мутаций методами ПЦР и прямого секвенирования с использованием не более 7 пар праймеров (рис. 7).

Поскольку патологическая экспансия повтора в промоторной области CSTB приводит к нарушению синтеза соответствующей мРНК и белкового продукта, определение экспрессии транскрипта методом ОТ-ПЦР в реальном времени и/или белка методом вестерн-блоттинга может служить дополнительной диагностической процедурой (рис. 8).

Прогрессивная миоклонус-эпилепсия – один из примеров болезней экспансии, для диагностики которых практически с равным успехом могут применяться разнообразные лабораторные подходы.

Миотоническая дистрофия.

Миотоническая дистрофия (МД) – аутосомно-доминантное мультисистемное заболевание с вариабельными клиническими проявлениями и выраженной антиципацией. У больных с МД наблюдаются многообразные и, на первый взгляд, абсолютно не связанные друг с другом, симптомы – миотония, мышечная дистрофия, нарушения сердечной проводимости, катаракта, эндокринные расстройства. Врожденная форма заболевания может проявляться множественными пороками развития, гипотонией, респираторным дистрессом и умственной отсталостью. Анализ сцепления показал, что МД может вызываться мутациями в двух различных генетических локусах, DM 1 и DM 2, расположенных соответственно в хромосомных сегментах 19q13 и 3q21. Миотоническая дистрофия 1-го типа (МД1) связана с экспансией повтора CTG, расположенного одновременно в 3’-нетранслируемой области гена протеинкиназы DMPK и в промоторной области гена SIX 5, на хромосоме 19q13. В 2001г. было показано, что мутации во втором генетическом локусе МД также относятся к мутациям экспансии повторяющихся последовательностей. Как и в случае МД1, повтор, подвергающийся экспансии при МД2, расположен в транскрибируемой, но нетранслируемой области структурного гена (ZNF 9). Повторяющаяся единица представляет собой тетрануклеотид CCTG. В норме длина повтора не превышает 26 тетрануклеотидов, в то время как при МД2 повтор претерпевает значительное увеличение – от 75 до 11000 повторяющихся единиц. Среднее значение длины повтора у больных с МД2 составляет приблизительно 5000 тетрануклеотидов.

Сходство клинических проявлений МД1 и МД2, так же как и общий характер мутаций, приводящих к двум формам миотонической дистрофии, указывает на то, что экспансии транскрибируемых повторов CТG и CCТG в РНК могут быть патогенными сами по себе и вызывать мультисистемные расстройства вне зависимости от хромосомного окружения и нормальных функций генов, содержащих эти повторы. Не существует никакой функциональной гомологии между РНК-связывающим белком ZNF9 и продуктами генов, расположенных в локусе DM 1. Не обнаружено также гомологий между генами локуса DM 2 (KIAA 1160, Rab 11B, glycoprotein IX, FLJ 11631, FLJ 12057) и генами локуса DM 1 (DMAHP, DMWD). Все это свидетельствует о том, что общие клинические проявления МД1 и МД2 не связаны с нарушением функционирования генов, расположенных вблизи повторов с экспансией, следовательно, анализ молекулярной патологии этих генов не может служить диагностическим целям при миотонической дистрофии. По всей видимости, молекулы мРНК с экспансией повторов CUG или CCUG образуют вторичные структуры в виде несовершенной двунитевой РНК, препятствуя тем самым нормальному энзиматическому расщеплению, нормальному созреванию и выходу молекул в цитоплазму. Это приводит к фокальному накоплению в ядре РНК, содержащих протяженные повторы CUG или CCUG. Фокальное внутриядерное накопление таких молекул показано для обоих типов МД. Очевидно, их высокая концентрация в ядре нарушает нормальное функционирование РНК-связывающих белков, приводя к мультисистемным расстройствам.

Поскольку экспансия микросателлитных повторов при МД не приводит к очевидным изменениям на уровне белковых продуктов, основным подходом к лабораторной диагностике обеих форм заболевания является ДНК-диагностика. Экспансия повторов при МД, достигающая тысяч и десятков тысяч единиц, определяется только методом гибридизации ДНК по Саузерну. Тем не менее ПЦР (рис. 9) также может применяться и в ДНК-диагностике МД – на первом, скрининговом этапе, когда выявление нормального гетерозиготного генотипа позволяет исключить диагноз МД у соответствующего пациента.

Результаты анализа длин микросателлитных повторов при миотонической дистрофии (рис. 9, 10 и 11) демонстрируют один из классических артефактов ПЦР-анализа протяженных микросателлитов, заключающийся в синтезе дополнительных, неспецифических продуктов реакции, длина которых кратна длине основной единицы микросателлитного повтора (три нуклеотида в случае CTG-повтора при МД1 и четыре – в случае CCTG-повтора при МД2). Характерным свойством этого явления является повышение относительной интенсивности артефактных сигналов по мере увеличения длины анализируемого повтора.

Причины недостаточно специфичного воспроизведения длин аллелей микросателлитных повторов в процессе ПЦР in vitro аналогичны таковым собственно процесса их экспансии in vivo. Как видно из уже приведенных описаний примеров болезней экспансии, для большинства из них характерны уникальные механизмы молекулярного патогенеза. В то же время, предполагается, что механизмы собственно экспансии различных коротких повторов могут носить универсальный характер. Это предположение основано на наличии двух характеристик, присущих всем микросателлитным повторам, подверженным динамической мутации. Одно из этих свойств – наличие барьера, равного приблизительно 30 повторам, по достижении которого тринуклеотидный тракт теряет стабильность, второе – скачкообразное одномоментное прибавление большого числа дополнительных копий повтора в случае экспансии.   

Достаточно протяжённые монотонные последовательности ДНК, каковыми и являются микросателлитные повторы, ассоциированные с болезнями экспансии, предрасположены к скольжению вновь синтезированной нити относительно матрицы при репликации. Существует модель, которая подразумевает участие фрагментов Оказаки в этом процессе. Средняя длина фрагмента Оказаки – 150-200 п.н. Не исключена вероятность, что весь фрагмент Оказаки или только его 3’-конец окажется в пределах микросателлитного повтора. В первом случае повтор длиной более 70 триплетов, не фиксированный по краям уникальными последовательностями, сможет свободно скользить вдоль комплементарной цепи с образованием шпилек (рис. 12, Б). Во втором случае, 5’-конец фрагмента Оказаки фиксирован уникальной последовательностью гена, другой же конец также сможет скользить свободно и образовывать вторичные структуры (рис. 12, А). В обоих случаях в отсутствие эффективной репарации произойдёт более или менее выраженная экспансия повтора. Таким образом, свободный конец дочерней цепи ДНК в области монотонной последовательности представляет собой потенциальную угрозу неадекватного воспроизведения длин аллелей микросателлитных повторов в процессе репликации ДНК. В живом организме разрешение необычной структуры, представляющей собой непроцессированный конец фрагмента Оказаки, происходит при участии системы рекомбинационной репарации. В целом же, чтобы избежать потенциальной опасности, которую представляет собой непроцессированный конец фрагмента Оказаки, необходима нормальная работа эндонуклеаз (в частности, RAD27), системы рекомбинационной репарации и системы репарации неспаренных нуклеотидов. При амплификации микросателлитных повторов in vitro репарация ошибок, возникающих в результате проскальзывания дочерней цепи ДНК, невозможна вследствие отсутствия соответствующих ферментных систем. Вследствие этого и наблюдается наработка кратных продуктов ПЦР, сигналы детекции которых затухают по мере удаления от истинной длины микросателлита, и относительная интенсивность которых возрастает по мере удлинения определяемых аллелей.

Аналогичный эффект наблюдается и в живых системах при повреждении механизмов репарации ДНК. В частности, такое явление, получившее название микросателлитной нестабильности, описано у больных с наследственным неполипозным раком толстого кишечника (рис. 13). Нестабильность микросателлитов при этом охватывает геном в целом и носит неспецифический характер.

Таким образом, репликация ДНК - необходимое условие возникновения погрешностей точного воспроизведения копийности микросателлитного повтора, в особенности, достаточно протяженного (свыше 30 единиц). Поэтому более строгая детекция микросателлитов возможна только при условии исключения этапа воспроизведения ДНК, в том числе ПЦР. Одним из методов определения длин микросателлитных маркеров, не требующих аплификации ДНК – метод блот-гибридизации по Саузерну. Блот-гибридизация не только свободна от артефактов амплификации микросателлитов, но и позволяет выявлять повторы, длины которых находятся за пределами возможностей ПЦР и составляют десятки тысяч нуклеотидов.

Наиболее распространенный ДНК-зонд для диагностики МД1 методом блот-гибридизации, pGB2.2, представляет собой фрагмент гена DMPK, охватывающий 5-8 экзоны (рис. 14) и расположенный в пределах одного продукта рестрикции геномной ДНК эндонуклеазой EcoRI с гипервариабельной областью CTG-повтора гена. Гибридизация с этим зондам образцов ДНК, обработанных EcoRI, позволяет определить размеры CTG-повтора, а также наличие или отсутствие Alu-инсерции (нормальный инсерционно-делеционный полиморфизм) в восьмом интроне гена. В норме на радиоавтографах детектируются фрагменты ДНК длиной около 9 т.п.н. при отсутствии инсерции Alu, длиной около 10 т.п.н. при наличии инсерции Alu, или оба варианта при наличии обоих состояний (рис. 15, 16).

Результаты ДНК-диагностики МД1 методом блот-гибридизации демонстрируют отсутствие артефактных сигналов, характерных для ПЦР-продуктов. В то же время, случаи незначительных экспансий по результатам блот-гибридизации не поддаются однозначной интерпретации (рис. 15) и требуют дополнительной валидации методом ПЦР. Кроме того, в случаях обширных экспансий патологические аллели визуализируются на радиоавтографах в виде шмеров (рис. 16), не допускающих точное определение количества CTG-повторов. Справедливости ради следует отметить, что аллели таких длин (около 1000 повторов) не поддаются определению иными методами в принципе, а знание точного количества повторов при таких масштабах экспансии не имеет принципиального диагностического значения.

         Для диагностики МД2 методом блот-гибридизации используется ДНК-зонд ZNF9, представляющий собой фрагмент первого интрона гена ZNF 9 и расположенный в пределах одного продукта рестрикции геномной ДНК эндонуклеазой EcoRI с гипервариабельной областью CСTG-повтора гена (рис. 17). 

Метод блот-гибридизации по Саузерну позволяет эффективно выявлять масштабные экспансии микросателлитных повторов при МД (рис. 18). В то же время незначительно увеличенные повторы, приводящие к МД, могут ускользать при использовании такого метода диагностики. Определение небольших экспансий эффективно осуществляется при помощи ПЦР. Метод ПЦР целесообразно применять на первом, скрининговом этапе диагностики. Образцы, которые в результате ПЦР-анализа не удается классифицировать как нормальные или содержащие аллели с экспансией, должны проходить дальнейшую проверку методом блот-гибридизации. Такой комбинированный поэтапный подход является наиболее эффективным с точки зрения себестоимости и трудоемкости анализа в целом.

Для детекции протяженных экспансий микросателлитных повторов, наблюдаемых при МД1 и МД2, и даже более выраженных экспансий, в частности, ассоциированных со спиноцеребеллярной атаксией 10-го типа (свыше 20 т.п.н.), разработан также метод флуоресцентной повтор-праймированной ПЦР-детекции.