Глава 12. Молекулярно-генетическая диагностика болезней экспансии повторяющихся последовательностей

Общие принципы лабораторной диагностики болезней экспансии.

Экспансия повторов, расположенных в разных локусах, приводит к проявлению различных, в большинстве случаев строго определенных, патологических фенотипов, однако сам характер мутации, заключающийся в значительном увеличении длин повторяющихся геномных последовательностей, позволяет проводить ДНК-диагностику заболеваний этой группы однотипными методами.

Существует два принципиальных подхода к выявлению экспансии коротких повторов. Экспансии в пределах 120 повторов регистрируются методом ПЦР. Методической основой ДНК-диагностики в этих случаях служит амплификация полиморфного повтора с праймеров, фланкирующих область повтора, с последующей визуализацией продуктов амплификации в агарозном или полиакриламидном геле. Это относится к подавляющему большинству болезней экспансии кодирующих повторов.

Болезни экспансии некодирующих микросателлитов обычно сопровождаются более значительными изменениями длин повторов. Размеры трактов часто достигают в этих случаях нескольких сотен и даже тысяч повторяющихся единиц. Современные технологии ПЦР пока не в состоянии обеспечить надёжную детекцию столь протяженных участков повторяющейся ДНК, поэтому основным методом ДНК-диагностики болезней экспансии некодирующих повторов в настоящее время остаётся блот-гибридизационный анализ ДНК, гидролизованной эндонуклеазами рестрикции. Экспансия повтора в этом случае определяется по наличию фрагментов рестрикции повышенной молекулярной массы. Более подробно принцип метода изложен в разделе 5.

Для выявления возможной экспансии тринуклеотидных повторов в случаях, когда анализ уже известных локусов не позволяет установить точный диагноз, используется технология RED (repeat expansion detection – детекция экспансии повторов), позволяющая проводить скрининг всего генома на наличие потенциально патогенных экспансий.

Принцип метода RED заключается в отжиге олигонуклеотидов, представляющих собой тринуклеотидные повторы длиной 15-20 триплетов, в комплементарных областях генома с последующим лигированием соседних олигонуклеотидов и денатурацией их с матрицы. Цикл отжига-лигирования-денатурации повторяется несколько сот раз, пока не накапливается достаточное для визуализации количество продукта, длина которого приблизительно соответствует максимальной длине искомого повтора в анализируемом образце (рис. 2). Технология RED была успешно применена для выявления причин нескольких типов спиноцеребеллярных атаксий.

Кроме определения длин повторов, основой для молекулярной диагностики болезней экспансии может служить выявление сопряженных изменений генетического материала или белковых продуктов. Такими изменениями могут быть аномальное метилирование ДНК в области повторов, нарушение синтеза белкового продукта или синтез белка с измененными свойствами (рис. 3).

Более подробно конкретные подходы к лабораторной диагностике болезней экспансии рассмотрим на примерах отдельных нозологических форм.

 

Миотоническая дистрофия.

Миотоническая дистрофия (МД) – аутосомно-доминантное мультисистемное заболевание с вариабельными клиническими проявлениями и выраженной антиципацией. У больных с МД наблюдаются многообразные и, на первый взгляд, абсолютно не связанные друг с другом, симптомы – миотония, мышечная дистрофия, нарушения сердечной проводимости, катаракта, эндокринные расстройства. Врожденная форма заболевания может проявляться множественными пороками развития, гипотонией, респираторным дистрессом и умственной отсталостью. Анализ сцепления показал, что МД может вызываться мутациями в двух различных генетических локусах, DM 1 и DM 2, расположенных соответственно в хромосомных сегментах 19q13 и 3q21. Миотоническая дистрофия 1-го типа (МД1) связана с экспансией повтора CTG, расположенного одновременно в 3’-нетранслируемой области гена протеинкиназы DMPK и в промоторной области гена SIX 5, на хромосоме 19q13. В 2001г. было показано, что мутации во втором генетическом локусе МД также относятся к мутациям экспансии повторяющихся последовательностей. Как и в случае МД1, повтор, подвергающийся экспансии при МД2, расположен в транскрибируемой, но нетранслируемой области структурного гена (ZNF 9). Повторяющаяся единица представляет собой тетрануклеотид CCTG. В норме длина повтора не превышает 26 тетрануклеотидов, в то время как при МД2 повтор претерпевает значительное увеличение – от 75 до 11000 повторяющихся единиц. Среднее значение длины повтора у больных с МД2 составляет приблизительно 5000 тетрануклеотидов.

Сходство клинических проявлений МД1 и МД2, так же как и общий характер мутаций, приводящих к двум формам миотонической дистрофии, указывает на то, что экспансии транскрибируемых повторов CТG и CCТG в РНК могут быть патогенными сами по себе и вызывать мультисистемные расстройства вне зависимости от хромосомного окружения и нормальных функций генов, содержащих эти повторы. Не существует никакой функциональной гомологии между РНК-связывающим белком ZNF9 и продуктами генов, расположенных в локусе DM 1. Не обнаружено также гомологий между генами локуса DM 2 (KIAA 1160, Rab 11B, glycoprotein IX, FLJ 11631, FLJ 12057) и генами локуса DM 1 (DMAHP, DMWD). Все это свидетельствует о том, что общие клинические проявления МД1 и МД2 не связаны с нарушением функционирования генов, расположенных вблизи повторов с экспансией, следовательно, анализ молекулярной патологии этих генов не может служить диагностическим целям при миотонической дистрофии. По всей видимости, молекулы мРНК с экспансией повторов CUG или CCUG образуют вторичные структуры в виде несовершенной двунитевой РНК, препятствуя тем самым нормальному энзиматическому расщеплению, нормальному созреванию и выходу молекул в цитоплазму. Это приводит к фокальному накоплению в ядре РНК, содержащих протяженные повторы CUG или CCUG. Фокальное внутриядерное накопление таких молекул показано для обоих типов МД. Очевидно, их высокая концентрация в ядре нарушает нормальное функционирование РНК-связывающих белков, приводя к мультисистемным расстройствам.

Поскольку экспансия микросателлитных повторов при МД не приводит к очевидным изменениям на уровне белковых продуктов, основным подходом к лабораторной диагностике обеих форм заболевания является ДНК-диагностика. Экспансия повторов при МД, достигающая тысяч и десятков тысяч единиц, определяется только методом гибридизации ДНК по Саузерну. Тем не менее ПЦР (рис. 9) также может применяться и в ДНК-диагностике МД – на первом, скрининговом этапе, когда выявление нормального гетерозиготного генотипа позволяет исключить диагноз МД у соответствующего пациента.

Результаты анализа длин микросателлитных повторов при миотонической дистрофии (рис. 9, 10 и 11) демонстрируют один из классических артефактов ПЦР-анализа протяженных микросателлитов, заключающийся в синтезе дополнительных, неспецифических продуктов реакции, длина которых кратна длине основной единицы микросателлитного повтора (три нуклеотида в случае CTG-повтора при МД1 и четыре – в случае CCTG-повтора при МД2). Характерным свойством этого явления является повышение относительной интенсивности артефактных сигналов по мере увеличения длины анализируемого повтора.

Причины недостаточно специфичного воспроизведения длин аллелей микросателлитных повторов в процессе ПЦР in vitro аналогичны таковым собственно процесса их экспансии in vivo. Как видно из уже приведенных описаний примеров болезней экспансии, для большинства из них характерны уникальные механизмы молекулярного патогенеза. В то же время, предполагается, что механизмы собственно экспансии различных коротких повторов могут носить универсальный характер. Это предположение основано на наличии двух характеристик, присущих всем микросателлитным повторам, подверженным динамической мутации. Одно из этих свойств – наличие барьера, равного приблизительно 30 повторам, по достижении которого тринуклеотидный тракт теряет стабильность, второе – скачкообразное одномоментное прибавление большого числа дополнительных копий повтора в случае экспансии.   

Достаточно протяжённые монотонные последовательности ДНК, каковыми и являются микросателлитные повторы, ассоциированные с болезнями экспансии, предрасположены к скольжению вновь синтезированной нити относительно матрицы при репликации. Существует модель, которая подразумевает участие фрагментов Оказаки в этом процессе. Средняя длина фрагмента Оказаки – 150-200 п.н. Не исключена вероятность, что весь фрагмент Оказаки или только его 3’-конец окажется в пределах микросателлитного повтора. В первом случае повтор длиной более 70 триплетов, не фиксированный по краям уникальными последовательностями, сможет свободно скользить вдоль комплементарной цепи с образованием шпилек (рис. 12, Б). Во втором случае, 5’-конец фрагмента Оказаки фиксирован уникальной последовательностью гена, другой же конец также сможет скользить свободно и образовывать вторичные структуры (рис. 12, А). В обоих случаях в отсутствие эффективной репарации произойдёт более или менее выраженная экспансия повтора. Таким образом, свободный конец дочерней цепи ДНК в области монотонной последовательности представляет собой потенциальную угрозу неадекватного воспроизведения длин аллелей микросателлитных повторов в процессе репликации ДНК. В живом организме разрешение необычной структуры, представляющей собой непроцессированный конец фрагмента Оказаки, происходит при участии системы рекомбинационной репарации. В целом же, чтобы избежать потенциальной опасности, которую представляет собой непроцессированный конец фрагмента Оказаки, необходима нормальная работа эндонуклеаз (в частности, RAD27), системы рекомбинационной репарации и системы репарации неспаренных нуклеотидов. При амплификации микросателлитных повторов in vitro репарация ошибок, возникающих в результате проскальзывания дочерней цепи ДНК, невозможна вследствие отсутствия соответствующих ферментных систем. Вследствие этого и наблюдается наработка кратных продуктов ПЦР, сигналы детекции которых затухают по мере удаления от истинной длины микросателлита, и относительная интенсивность которых возрастает по мере удлинения определяемых аллелей.

Аналогичный эффект наблюдается и в живых системах при повреждении механизмов репарации ДНК. В частности, такое явление, получившее название микросателлитной нестабильности, описано у больных с наследственным неполипозным раком толстого кишечника (рис. 13). Нестабильность микросателлитов при этом охватывает геном в целом и носит неспецифический характер.

Таким образом, репликация ДНК - необходимое условие возникновения погрешностей точного воспроизведения копийности микросателлитного повтора, в особенности, достаточно протяженного (свыше 30 единиц). Поэтому более строгая детекция микросателлитов возможна только при условии исключения этапа воспроизведения ДНК, в том числе ПЦР. Одним из методов определения длин микросателлитных маркеров, не требующих аплификации ДНК – метод блот-гибридизации по Саузерну. Блот-гибридизация не только свободна от артефактов амплификации микросателлитов, но и позволяет выявлять повторы, длины которых находятся за пределами возможностей ПЦР и составляют десятки тысяч нуклеотидов.

Наиболее распространенный ДНК-зонд для диагностики МД1 методом блот-гибридизации, pGB2.2, представляет собой фрагмент гена DMPK, охватывающий 5-8 экзоны (рис. 14) и расположенный в пределах одного продукта рестрикции геномной ДНК эндонуклеазой EcoRI с гипервариабельной областью CTG-повтора гена. Гибридизация с этим зондам образцов ДНК, обработанных EcoRI, позволяет определить размеры CTG-повтора, а также наличие или отсутствие Alu-инсерции (нормальный инсерционно-делеционный полиморфизм) в восьмом интроне гена. В норме на радиоавтографах детектируются фрагменты ДНК длиной около 9 т.п.н. при отсутствии инсерции Alu, длиной около 10 т.п.н. при наличии инсерции Alu, или оба варианта при наличии обоих состояний (рис. 15, 16).

Результаты ДНК-диагностики МД1 методом блот-гибридизации демонстрируют отсутствие артефактных сигналов, характерных для ПЦР-продуктов. В то же время, случаи незначительных экспансий по результатам блот-гибридизации не поддаются однозначной интерпретации (рис. 15) и требуют дополнительной валидации методом ПЦР. Кроме того, в случаях обширных экспансий патологические аллели визуализируются на радиоавтографах в виде шмеров (рис. 16), не допускающих точное определение количества CTG-повторов. Справедливости ради следует отметить, что аллели таких длин (около 1000 повторов) не поддаются определению иными методами в принципе, а знание точного количества повторов при таких масштабах экспансии не имеет принципиального диагностического значения.

         Для диагностики МД2 методом блот-гибридизации используется ДНК-зонд ZNF9, представляющий собой фрагмент первого интрона гена ZNF 9 и расположенный в пределах одного продукта рестрикции геномной ДНК эндонуклеазой EcoRI с гипервариабельной областью CСTG-повтора гена (рис. 17). 

Метод блот-гибридизации по Саузерну позволяет эффективно выявлять масштабные экспансии микросателлитных повторов при МД (рис. 18). В то же время незначительно увеличенные повторы, приводящие к МД, могут ускользать при использовании такого метода диагностики. Определение небольших экспансий эффективно осуществляется при помощи ПЦР. Метод ПЦР целесообразно применять на первом, скрининговом этапе диагностики. Образцы, которые в результате ПЦР-анализа не удается классифицировать как нормальные или содержащие аллели с экспансией, должны проходить дальнейшую проверку методом блот-гибридизации. Такой комбинированный поэтапный подход является наиболее эффективным с точки зрения себестоимости и трудоемкости анализа в целом.

Для детекции протяженных экспансий микросателлитных повторов, наблюдаемых при МД1 и МД2, и даже более выраженных экспансий, в частности, ассоциированных со спиноцеребеллярной атаксией 10-го типа (свыше 20 т.п.н.), разработан также метод флуоресцентной повтор-праймированной ПЦР-детекции.

 

Атаксия Фридрейха

Атаксия Фридрейха (АФ) – заболевание с аутосомно-рецессивным типом наследования. Этим объясняется тот факт, что АФ - единственная болезнь экспансии некодирующих микросателлитных повторов, при которой не отмечено антиципации. Клинические проявления заболевания включают атаксию, дизартрию, ослабление рефлексов, кардиомиопатию и диабет. При атаксии Фридрейха показана дегенерация нейронов спинного мозга, ганглиев дорсальных корешков и некоторых периферических сенсорных систем. Заболевание вызвано экспансией внутриинтронного повтора GAA в гене Х25 (ген фратаксина), приводящей к снижению экспрессии гена. Предполагается, что возникающая в результате экспансии протяженная повторяющаяся АТ-богатая последовательность образует необычные структуры, затрудняющие нормальную транскрипцию.

Метод повтор-праймированной ПЦР эффективно выявляет все варианты генотипов GAA-повтора в гене фратаксина (рис. 21).

 

5.5. Экспансии некодирующих повторов, ассоциированные с экспрессией ломких хромосомных участков.

Ломкими (фрагильными – от англ. fragile, хрупкий) хромосомными участками называются районы с повышенной частотой возникновения цитогенетически определяемой ломкости после культивировании клеток в особых условиях. Хроматин в ломких участках не компактизируется при подготовке клетки к митозу. Ломкие участки классифицируются прежде всего по их распространённости в нормальной популяции. Распространённые (общие) ломкие участки рассматриваются как элементы нормальной структуры хромосом, однако степень их экспрессии индивидуальна и у разных представителей одной популяции может различаться. Частота редких участков варьирует от 1 на 40 хромосом для FRA16B и 1 на 80 для FRA10B до единичных случаев (например, FRA1M в 1р21.3).

Как редкие, так и общие ломкие участки подразделяются в соответствии с условиями культивирования, необходимыми для индукции их цитогенетической экспрессии. Подавляющее большинство клонированных к настоящему моменту ломких участков относятся к группе редких фолатчувствительных. Эти ломкие участки содержат полиморфные повторы (CGG)n. Экспансия таких повторов представляет собой динамическую мутацию, проходящую в своём развитии две стадии: премутации и полной мутации. Премутации (обычно 55-230 триплетов) характеризуются значениями длины повтора, превышающими нормальные, но не сопровождающимися экспрессией ломкого участка. Превышение порогового значения длины тринуклеотидного повтора приводит к метилированию CpG-динуклеотидов в повторе и экспрессии ломкого участка. Такое состояние называется полной мутацией.

In vitro фолатчувствительные ломкие участки экспрессируются при пониженной концентрации dTTP или dCTP в культуральной среде. Такие условия создаются при дефиците фолиевой кислоты (отсюда название – фолатчувствительные ломкие участки) или тимидина, либо при добавлении ингибиторов метаболизма фолата (метотрексат). Предполагается, что в условиях дефицита dCTP репликация не может быть завершена в стандартные сроки. В результате ломкий участок представляет собой участок однонитевой ДНК, премитотическая компактизация которой нарушена.

Вторым обязательным условием экспрессии фолатчувствительных ломких участков является пребывание CGG-повтора в состоянии полной мутации. В то время, как дефицит dTTP или dCTP нарушает репликацию в области ломкого участка, метилирование полной мутации нарушает нормальную структуру хроматина.

Очевидно, эти два условия являются обязательными, но не исчерпывающими, поскольку при полном их соблюдении до сих пор не удается получить более чем 30% экспрессию ломкости.

Выявление в 1969 г. ломкого участка, расположенного на границе Xq27 и Xq28 и получившего позднее название FRAXA(рис. 22) у мужчин с умственной отсталостью (УО) явилось первым лабораторным диагностическим признаком одной из болезней экспансии тринуклеотидных повторов - синдрома Мартина-Белл (СМБ). В то же время были описаны семьи, у членов которых проявлялись клинические признаки СМБ, но не экспрессировался FRAXA. С другой стороны, были отмечены случаи сегрегации фолатчувствительного ломкого участка в X(q27.3-q28), не сопровождавшиеся фенотипом УО. В сочетании с невозможностью достичь хотя бы 50%-ной экспрессии фолатчувствительного ломкого сайта у больных и наличием фонового уровня хромосомной ломкости в области Xq27, перечисленные факты говорят о неудовлетворительной чувствительности и специфичности цитогенетической диагностики состояний, ассоциированных с ломкими хромосомными участками. Даже если на основании клинических признаков и анализа родословной высказывается подозрение на синдром Мартина-Белл, технически не всегда легко обнаружить патогномоничный ломкий сайт в Xq27.3. Цитогенетический анализ даёт особенно низкий диагностический выход при анализе носительства у женщин. Кроме того, цитогенетическая диагностика СМБ нередко приводит к ложноположительным результатам. В проведенном нами исследовании цитогенетическая экспрессия фолатчувствительного ломкого участка в длинном плече Х-хромосомы документирована для 3% больных с УО (17 из 470). В дальнейшем при использовании молекулярно-генетических методов анализа, было выявлено 18% (3 из 17) ложноположительных диагнозов СМБ, поставленных на основании выявления фолатчувствительных ломких хромосомных участков. Ложноотрицательных диагнозов СМБ, поставленных на основании выявления хромосомной ломкости, не отмечено. Полученные данные согласуются с результатами исследований, проведённых в ряде стран мира: при молекулярно-генетическом анализе образцов крови больных с диагнозом СМБ, поставленным ранее на основании выявления фолатчувствительных ломких участков Х-хромосомы, значительная часть диагнозов признана ложноположительными. В свете этой информации оценки частоты СМБ в общей популяции стали более скромными: 1: 3000-4000 мужчин в настоящее время против 1: 1000 в конце 80-х гг. Развитие молекулярно-генетических методов, ставшее возможным после идентификации генов соответствующих заболеваний, открыло новые возможности лабораторной диагностики и значительно повысило её достоверность.

Наиболее изучены с точки зрения молекулярной структуры три фолат-чувствительных ломких участка, расположенные в пределах относительно небольшой, немногим более 1 м.н.п., области длинного плеча Х-хромосомы. Это ломкий сайт FRAXA (Xq27.3) и ломкие сайты FRAXE и FRAXF, расположеные в Xq28 на расстоянии около 600 т.н.п. и 1200 т.п.н. от FRAXA соответственно (рис. 23). Все три участка содержат нестабильные тандемные CG-богатые повторы, экспансия которых приводит к аномальному метилированию прилежащих CpG-островков.

Литература.

1. Введение в молекулярную медицину: под ред. Пальцева М.А. Москва, «Медицина», 2004 г.

2. Cagnoli Claudia, Chiara Michielotto, Tohru Matsuura, Tetsuo Ashizawa, Russell L. Margolis, Susan E. Holmes, Cinzia Gellera, Nicola Migone, and Alfredo Brusco //Detection of Large Pathogenic Expansions in FRDA1, SCA10, and SCA12 Genes Using a Simple Fluorescent Repeat-Primed PCR Assay// J. Mol. Diagn., 2004; 6: 96 - 100.

3. Carson NL //Analysis of repetitive regions in myotonic dystrophy type 1 and 2//
Curr Protoc Hum Genet, 2009; Chapter 9: Unit 9.6.

4. Joensuu T, Kuronen M, Alakurtti K, Tegelberg S, Hakala P, Aalto A, Huopaniemi L, Aula N, Michellucci R, Eriksson K, Lehesjoki AE// Cystatin B: mutation detection, alternative splicing and expression in progressive myclonus epilepsy of Unverricht-Lundborg type (EPM1) patients// Eur J Hum Genet 2007 15(2):185-193.

5. Strelnikov V, M Nemtsova, G Chesnokova, N Kuleshov, and D Zaletayev //A simple multiplex FRAXA, FRAXE, and FRAXF PCR assay convenient for wide screening programs//
Hum Mutat, 1999; 13(2): 166-169.

 

 

Глава 12. Молекулярно-генетическая диагностика болезней экспансии повторяющихся последовательностей

   Стрельников В.В., Кузнецова Е.Б., Немцова М.В.

 

1. Болезни экспансии микросателлитных повторов - особый класс патогенных мутаций у человека.

Экспансия микросателлитных повторов – новый класс патогенных мутаций у человека, впервые описанный в 1991г. За прошедшее время список болезней экспансии пополнился десятками новых форм (табл. 1, 2 и 3).

Болезни экспансии объединены несколькими общими свойствами. Во-первых, мутантные повторы проявляют как мейотическую, так и митотическую нестабильность, причем в большинстве случаев наблюдается увеличение, а не сокращение числа повторяющихся единиц в ряду поколений. Во-вторых, отмечена корреляция между длиной повторов и возрастом начала заболевания, а также выраженностью клинической картины. Такое явление получило название антиципации. В-третьих, риск экспансии в большинстве случаев зависит от родительского происхождения аллеля.

Молекулярные механизмы этиопатогенеза болезней экспансии зависят как от состава и числа нуклеотидов, образующих повторяющиеся единицы, так и от расположения повторов относительно кодирующих участков генома. В связи с этим выделяют болезни экспансии кодирующих и некодирующих повторов. Первую группу составляют исключительно болезни экспансии тринуклеотидных повторов, поскольку составляющие их единицы представляют собой полноценные кодоны и изменение их числа не приводит к сдвигу рамки считывания. Такие повторы кодируют гомополиаминокислотные тракты, экспансия которых характерна для ряда нейродегенеративных заболеваний и синдромов МВПР (множественные врожденные пороки развития).

Болезни экспансии некодирующих повторов обусловлены значительным увеличением длины повторяющихся последовательностей и сопровождаются множественной дисфункцией или дегенерацией различных тканей. Клинические проявления каждого заболевания вариабельны, возможно, вследствие выраженной соматической гетерогенности мутаций. Аллели некодирующих повторов с явной экспансией обычно происходят из небольшого пула аллелей промежуточного размера. Степень экспансии, сопровождающаяся клиническими проявлениями заболевания, называется полной мутацией, а промежуточные размеры повторов обозначают термином «премутация».

 

2. Микросателлитные повторы как субстрат для развития болезней экспансии. Влияние структуры микросателлитного повтора на определение тактики ДНК-диагностики.

Микросателлиты являются неотъемлемой частью любого генома, они обнаружены как у про- так и у эукариот и могут располагаться как в кодирующих, так и в некодирующих участках. Благодаря высокой скорости мутирования, микросателлиты играют важную роль в эволюции геномов, создавая и поддерживая количественное генетическое разнообразие. Микросателлиты не являются пассивными элементами геномов. Полиморфные микросателлитные последовательности, расположенные в промоторных областях генов, участвуют в регуляции транскрипционной активности. Длина полипролиновых и полиглутаминовых трактов, кодируемых микросателлитными тринуклеотидными повторами, определяет характер белок-белковых взаимодействий, в том числе с молекулами транскрипционных факторов.

Разные микросателлитные последовательности по-разному расположены в геноме. Ди-, тетра-, и пентануклеотидные повторы обнаруживаются в кодирующих областях генов значительно реже, чем три- и гексануклеотидные. Такое распределение микросателлитов вполне объяснимо: изменение длины повторов первой группы в пределах кодирующей области должно с высокой вероятностью приводть к сдвигу рамки считывания и нарушению синтеза белка. Полиморфизм же три- и гексануклеотидных повторов не приводит к сдвигу рамки считывания и, в разумных пределах, не нарушает структуры и функции кодируемого белка.

Высокая степень полиморфизма является одним из характерных свойств микросателлитных последовательностей. Существует прямая зависимость между средней длиной микросателлитного повтора и его гетерозиготностью в нормальной популяции. Показано, например, что информативность динуклеотидных СА-маркеров варьирует от 0 для повторов с длиной 10 и менее повторяющихся единиц до 0.8 для повторов с длиной 24 и более единиц (рис. 1А). Информативность маркеров, содержащих вставки нуклеотидов, нарушающих целостность повтора, значительно ниже, чем информативность «чистых» повторов. Как показано на рис. 1Б, информативность несовершенного повтора целиком зависит от длины его «чистого» участка. 

Знание основных предпосылок стабильности/нестабильности микросателлитных повторов является необходимым условием разработки адекватных методов молекулярно-генетической диагностики, причем не только болезней экспансии. В последнее время все чаще ощущается необходимость уплотнения сетки высокоинформативных полиаллельных маркеров на пространстве критических хромосомных областей. Разработка панелей микросателлитных маркеров повышенной плотности призвана обеспечить более точное картирование точек разрыва при микроделеционных синдромах и границ областей потери гетерозиготности при онкологических заболеваниях, способствует повышению информативности и достоверности косвенной ДНК-диагностики. Существующие панели микросателлитных маркеров с охарактеризованными показателями гетерозиготности и аллельных частот, разработанные свыше десяти лет назад, не удовлетворяют современным требованиям диагностики, прежде всего, с точки зрения плотности расположения маркеров: расстояния между аннотированными полиморфными микросателлитами может превышать 1 млн.н.п. Поэтому детальная характеристика критического хромосомного района на современном уровне требует вовлечения новых, ранее не охарактеризованных микросателлитных повторов. Первичный отбор таких потенциальных маркеров как раз и предполагает обязательный учет средней протяженности каждого из них и протяженности непрерывных трактов в составе несовершенных повторов. Практический пример разработки панели микросателлитных маркеров для косвенной ДНК-диагностики болезни экспансии тринуклеотидных повторов – синдрома Мартина-Белл – приводится в разделе 5.5.1.2.

В прямой ДНК-диагностике и в понимании этиопатогенеза, эволюции и популяционной генетики болезней экспансии микросателлитных повторов структурные основы стабильности микросателлитов играют ещё большую роль. Для ряда болезней экспансии уже описана ассоциация нестабильности тринуклеотидных трактов со степенью совершенства повторов. В частности, нормальные аллели гена SCA 1 (спиноцеребеллярная атаксия 1-го типа) с длиной CAG-повтора свыше 21 триплета содержат от 1 до 3 вкраплений CAT, в то время как аллели с экспансией содержат только чистые тракты CAG. Большинство нормальных аллелей гена FMR 1 (синдром Мартина-Белл) содержат два AGG-вкрапления, нарушающих чистоту CGG-повтора. Тринуклеотиды AGG занимают, как правило, место десятой и двадцатой повторяющихся единиц, т.е., структуру «нормального» повтора можно выразить формулой:

(CGG)9- AGG -(CGG)9- AGG -(CGG)n,

где n £ 33. Т.о., несовершенство повтора обнаруживается в его 5’-конце, а полиморфизм длины полярен и обеспечивается различиями в 3’-конце. Аллели с такой структурой наследуются стабильно. В нестабильно наследуемых аллелях теряются одна или обе вставки AGG, либо происходит смещение вставки:

(CGG)9-12- AGG -(CGG)n или (CGG)n,

где n > 33. Потеря вставки может быть результатом как делеции, так и однонуклеотидной замены А на С. Определение внутренней структуры повтора, длина которого соответствует «серой зоне» - критической области длин, в которую попадают как максимально протяженные нормальные аллели, так и наиболее короткие премутационные аллели – может иметь решающее значение с точки зрения прогноза трансформации в премутацию в потомстве.

Несовершенство тринуклеотидных повторов в генах некоторых болезней экспансии может в значительной степени стабилизировать потенциально полиморфную область. Так, вариабельность длин тринуклеотидных повторов, кодирующих полиаланиновые тракты, весьма незначительна. Это связано со структурной гетерогенностью кодирующих полиаланин нуклеотидных последовательностей в геноме человека. В последовательностях, кодирующих полиаланин, встречаются все варианты аланиновых кодонов: GCG, GCA, GCT и GCC. Структурное разнообразие соответствующих тринуклеотидных повторов стабилизирует их длину. Применительно к молекулярно-генетической диагностике знание структуры повтора в случае конкретной болезни экспансии позволяет принимать обоснованные решения о применении более или менее сложных методов детекции экспансии повторов и сопутствующих генетических нарушений.