ДНК-диагностика синдрома Мартина-Белл методом блот-гибридизации ДНК.

В диагностике СМБ достаточно широко распространены протоколы, основанные на использовании метода гибридизации по Саузерну с использованием различных систем ДНК-зондов. ДНК-зонды для диагностики СМБ представляют собой фрагменты 1-го экзона гена FMR 1, расположенные вблизи гипервариабельной области гена. Гибридизация с этими зондами образцов ДНК, обработанных соответствующими эндонуклеазами рестрикции, позволяет не только определить размеры амплифицированного участка, т.е. число CGG повторов, но и оценить степень метилирования CpG-островка промоторной области гена. Предложенные системы ДНК-зондов используются как для дифференциальной диагностики СМБ, в т.ч. и пренатальной, так и для выявления бессимптомного носительства, т.е. состояния премутации гена FMR 1.

Исторически первая система ДНК-зондов основана на использовании клонов StB12 (StB12.1-StB12.5) и StA22 (рис. 24). Система HindIII/StB12.3 применяется для выявления мутаций повтора в гене FMR 1, а BanI/StA22 - для анализа метилирования прилегающего CpG-островка. Для определения длины CGG-повтора наряду с StB12.3 часто применяется ДНК-зонд Ох1.9, который имеет большую длину и полностью перекрывает StB12.3 (рис.25, 26, 27). Оба зонда лежат в пределах одного фрагмента длиной около 5.2 т.п.н., являющегося продуктом обработки геномной ДНК ферментом HindIII и содержащего область нестабильного тринуклеотидного повтора CGG.

Выявление экспансии тринуклеотидного повтора CGG в первом экзоне гена FMR 1 методом блот-гибридизации в однорестриктазной системе позволяет подтвердить наличие у пациента синдрома Мартина-Белл. Однако, как показано в ряде публикаций, клиническая экспрессия СМБ коррелирует напрямую не со степенью экспансии повтора, а с уровнем метилирования CpG-островка гена FMR 1.

Метилирование CpG-динуклеотидов в области FRAXA исторически явилось первой выявленной на молекулярном уровне аномалией, позволившей отличать полные мутации при СМБ от премутаций. Метилируемые сайты расположены в области CpG-островка гена FMR 1. Для анализа метилирования этой области образцы ДНК обрабатывают метилчувствительными рестриктазами, проявляющими эндонуклеазную активность в области неметилированных CpG-островков, и не гидролизующими ДНК в области метилированных CpG-островков, характерных для промоторов генов в неактивном состоянии.

Неспособность оценить состояние метилирования CpG-островка является недостатком всех систем зондовой ДНК-диагностики СМБ, основанных на использовании одной рестриктазы (PstI/pfxa3, PstI/StB12.XX, EcoRI,HindIII /StB12.3, EcoRI,HindIII/Ox1.9, EcoRI,HindIII/pP2 и др.). В то же время одноферментные системы, использующие EcoRI или HindIII, визуализируют фрагменты ДНК, длины которых оптимальны для выявления премутаций. Кроме того, эти системы проще и дешевле систем двойной рестрикции, что делает их удобными для скрининга больных.

Системы двойной рестрикции с применением метилчувствительной рестриктазы (например, EagI или XhoI) и рестриктазы, индифферентной к метилированию ДНК (например, EcoRI) позволяют в одном эксперименте одновременно диагностировать экспансию CGG-повтора и состояние его метилирования (рис. 25, 28). Учитывая индивидуальные различия длины вариабельной части гена в норме (от 2 до 54 CGG-повторов), метод блот-гибридизации по Саузерну в системе EcoRI+EagI/StB12.3 позволяет идентифицировать в контрольных образцах ДНК один фрагмент длиной 2,7-2,8 т.п.н. у мужчин и два фрагмента длиной 2,7-2,8 и 5,1-5,2 т.п.н. у женщин. Рисунок 28 объясняет выявление фрагментов указанных длин при использовании системы EcoRI+EagI/StB12.3. Эта же система выявляет фрагменты длиной (2,7-2,8 т.п.н.)+m, где m - приращение длины повтора CGG при премутации в каждом конкретном случае, выраженное в т.п.н. У больных мужчин в этой системе выявляется фрагмент длиной (5,1-5,2 т.п.н.)+M, где М - длина инсерции CGG-повтора при полной мутации. Увеличение постоянной составляющей в этой формуле с 2,7-2,8 т.п.н. до 5,1-5,2 т.п.н. связано с неспособностью фермента EagI распознавать сайт рестрикции, метилированный у больных с полной мутацией.

В случае больных женщин, как и женщин - носительниц премутаций получаемые гибридизационные сигналы более сложны и разнообразны, что обусловлено, в частности, неоднозначностью процесса случайной Х-инактивации. В наиболее простом случае у женщины - носительницы премутации выявляются четыре полосы (рис. 28, дорожка 3), две из которых имеют нормальную длину, а длины двух других описываются формулой N_x+m, где N_x - длины каждого из двух нормальных фрагментов. Что же касается больных женщин, у них наиболее простая гибридизационная картина представляет собой три полосы - две нормальные, и одна, длина которой равна N_инакт.+М (здесь N_инакт.- длина фрагмента, соответствующего инактивированной Х-хромосоме).

Гибридизационная картина может осложняться мозаицизмом, как по метилированию, так и по числу CGG-повторов; неоднозначностью процессов Х-инактивации и рядом других факторов. На рис. 28 представлены лишь некоторые, наиболее распространённые, варианты.

       Несмотря на то, что использование системы EcoRI+EagI/StB12.3 приводит к получению столь разнообразных результатов, она остаётся одной из популярных систем молекулярной диагностики СМБ. Привлекательность её обусловлена двумя основными причинами. Во-первых, использование EcoRI+EagI/StB12.3 позволяет оценивать в одном тесте не только размер гипервариабельного участка гена FMR 1, но и статус метилирования прилегающего CpG-островка. Во-вторых, длина фрагментов, получаемых после обработки геномной ДНК рестриктазами EcoRI+EagI, видимо, является оптимальной для выявления мутаций экспансии в гене FMR 1 у мозаиков, в клетках периферической крови которых экспрессируется широкий спектр мутационных и премутационных аллелей. Гибридизационная картина в таких случаях может представлять собой сильно размытый шмер, который будет тем менее чётким, чем короче анализируемые фрагменты ДНК, поскольку короткие фрагменты лучше разделяются в агарозном геле (рис. 29).