ДНК-диагностика синдрома Мартина-Белл с использованием ПЦР.

В литературе известно множество протоколов использования ПЦР-анализа для определения экспансии CGG-повтора при СМБ. Его преимуществом является использование малых количеств ДНК. Однако большинство протоколов с использованием ПЦР не избавляет от необходимости проведения последующего блоттинга по Саузерну или использования радиоактивно меченых праймеров. Это обусловлено исключительными техническими трудностями, возникающими при амплификации протяжённого CG-богатого участка ДНК. Низкий выход продукта ПЦР делает невозможным его выявление традиционными методами. Кроме того, короткие фрагменты ДНК амплифицируются лучше (явление, известное как преимущественная амплификация коротких аллелей), что может приводить к гиподиагностике СМБ методами ПЦР. Спорными с этой точки зрения можно считать результаты ПЦР-анализа в случаях женщин с полной мутацией (имеющих нормальную Х-хромосому) и мозаиков обоего пола, у которых могут проявляться лишь премутационные аллели, амплифицирующиеся значительно эффективнее, чем аллели с полной мутацией.

Удовлетворительные результаты ПЦР-анализа длины CGG-повтора в первом экзоне FMR1 могут быть получены только в пределах нормальных длин повтора, либо при использовании 7-деаза-2'-дезоксигуанозин-5’-трифосфата с последующей гибридизацией продуктов амплификации (рис.30). Такой подход лишен всякого смысла, поскольку блот-гибридизация как таковая при этом не исключается из протокола, но теряет свои положительные качества, параллельно отягащаясь артефактами ПЦР.

Основная проблема ПЦР CGG-повтора, обусловленная высоким C,G-составом, может быть преодолена путем обработки ДНК бисульфитом натрия. Бисульфитная модификация ДНК в значительной степени изменяет первичную структуру CpG-богатых участков, конвертируя все неметилированные цитозиновые остатки в урацил. Таким образом, неметилированный CGG-повтор приобретает структуру (UGG)n, что значительно облегчает амплификацию соответствующего участка ДНК и позволяет однозначно выявлять аллели повтора FMR1 в пределах нормы/премутации (рис. 31). Использование в такой реакции флуоресцентно меченых праймеров и разделение продуктов реакции денатурирующим капиллярным электрофорезом позволяет усилить сигналы и значительно повысить точность определения длин повторов (рис. 32).

Следует отметить, что, несмотря на очевидные преимущества такой бисульфит-опосредованной (метилспецифической) ПЦР – МС-ПЦР, она все же не позволяет осуществлять амплификацию полномутационных аллелей, которые содержат CGG-повтор в метилированном состоянии. Обработка бисульфитом натрия оставляет метилированные остатки цитозина интактными, и CGG-повтор полностью сохраняет свою первичную структуру, препятствующую амплификации протяженных участков ДНК. Эта же особенность метилчувствительной ПЦР может искажать результаты анализа у мозаиков, а также в случаях неслучайной инактивации Х-хромосомы у женщин.

Наличие строгой корреляции между метилированным состоянием промотора гена FMR1 и фенотипическим проявлением СМБ у обследуемых мужского пола позволяет использовать для диагностики СМБ у мальчиков с умственной отсталостью изолированные (без определения длин повторов) тесты на метилирование CGG-повтора FMR1.

Использование метода блот-гибридизации для анализа метилирования CpG-островка гена FMR 1 независимо от длины CGG-повтора значительно упрощает интерпретацию результатов теста. Для проведения такого теста образцы геномной ДНК обрабатывают рестриктазой HpaII с последующей гибридизацией с зондом StB12.3. При исследовании ДНК нормальных мужчин в системе HpaII/StB12.3 выявляется константный фрагмент длиной 6.0 т.п.н. У мужчин с метилированным аллелем гена FMR 1 этот фрагмент не выявляется.

Блот-гибридизационный анализ метилирования позволяет обнаружить неметилированные аллели гена FMR 1. В диагностических целях этот тест практически не применяется, так как отсутствие сигнала в принципе не может служить диагностическим критерием, кроме того, для диагностики СМБ важно иметь информацию о противоположном параметре, а именно о наличии метилированных аллелей.

Однозначный ответ на вопрос о наличии метилированных аллелей гена FMR 1 у больного дает анализ метилирования с помощью ПЦР. Нами разработана тест-система, в которой состояние метилирования участка промотора гена FMR 1, расположенного между двумя специфическими олигонуклеотидными праймерами, определяется методом полимеразной цепной реакции с матрицы, обработанной чувствительной к метилированию рестриктазой HhaI (метилчувствительная ПЦР, МЧ-ПЦР). Поскольку выбранный нами участок промотора содержит сайты узнавания HhaI, продукт амплификации можно получить только с метилированной матрицы. В чистом виде такой метод обычно неприменим в диагностике состояния метилирования геномной ДНК, поскольку для однозначной интерпретации результатов необходимы, с одной стороны, гарантии абсолютно полной рестрикции матрицы (защита от ложноположительных результатов), и, с другой стороны, внутренний контроль амплификации (защита от ложноотрицательных результатов).

Полнота рестрикции матрицы может быть обеспечена выбором для анализа учаска промотора, содержащего не один, а не менее трёх сайтов узнавания рестриктазы, чувствительной к метилированию. Однако не всегда такой подход оказывается достаточно специфичным, поскольку в большинстве случаев в промоторах инактивированных генов метилируются не все CpG-динуклеотиды. Известны гены, для инактивации которых достаточно метилирования одного CpG-динуклеотида в составе промотора.

Для CpG-островка гена FMR 1 показано метилирование всех CpG-динуклеотидов у больных с полной мутацией, что позволяет включать любое число сайтов рестрикции HhaI в исследуемый фрагмент промотора. В частности, разработанные нами праймеры обеспечивают амплификацию участка промотора FMR 1 длиной 316 п.н., содержащего 9 сайтов узнавания этой рестриктазы, чем обеспечивается высокая надёжность диагностического метода при полном сохранении его специфичности.

Защита от ложноотрицательных результатов обеспечивается одновременной амплификацией с одной матрицы исследуемого фрагмента и фрагмента геномной ДНК, не содержащего сайтов узнавания HhaI. В качестве такого фрагмента, обеспечивающего внутренний контроль амплификации, нами использован участок CpG-островка гена MeCP 2, расположенного в Xq28. Протяжённость контрольного фрагмента составляет 105 п.н. Он расположен достаточно близко от FMR 1, но не захватывает область возможных микроделеций в районе FRAXA. В свою очередь, праймеры на промоторный участок гена FMR 1 подобраны таким образом, чтобы захватывать 5’-границу области описанных ранее микроделеций при СМБ, расположенную между 75 и 53 нуклеотидами проксимальнее CGG-повтора. При таком подборе праймеров отсутствие продукта ПЦР при амплификации негидролизованной матрицы может предполагать наличие у пациента делеции, как минимум, 5’-нетранслируемой области гена FMR 1.

Валидация метода диагностики состояния метилирования промотора гена FMR 1 проведена на образцах ДНК здоровых мужчин и больных мужского пола с диагнозом СМБ, подтвержденным цитогенетически и/или методом блот-гибридизации по Саузерну. У больных во всех случаях в исследуемых участках узнавания рестриктазы HhaI был выявлен метилцитозин, что выражалось в появлении продукта амплификации после обработки геномной ДНК указанной рестриктазой (рис. 33).

В свою очередь, для больных мужского пола, у которых диагноз СМБ был впервые подтверждён нами методом метилчувствительной ПЦР, методом блот-гибридизации было проведено определение длины тринуклеотидного повтора в промоторе FMR1 и выявлены фрагменты, соответствующие полномутационным аллелям.

Проверка состоятельности ПЦР-теста на метилирование области CpG-островка гена FMR 1, в том числе методом слепого контроля, показала не меньшую чувствительность этого метода по сравнению с гибридизацией по Саузерну. В то же время, известно, что чувствительность ПЦР как таковой значительно выше чувствительности блот-гибридизации, что позволяет ожидать выявление метилирования методом ПЦР в тех случаях, когда гибридизационный анализ оказывается недостаточно чувствительным или недостаточно однозначным.

Известно, что полные мутации при СМБ приводят к транскрипционной супрессии промотора гена FMR 1 вследствие метилирования его CpG-островка. Этот процесс, в конечном итоге, приводит к отсутствию белка FMRP, что, как считается, и является причиной умственной отсталости при СМБ. В литературе, однако, описано несколько случаев неметилированных полных мутаций при СМБ. Общее число подобных случаев не превышает десяти. Учитывая, что лишь за первые три года после открытия гена FMR 1 только методом блот-гибридизации по Саузерну было обследовано свыше 6000 пациентов, в том числе не менее 3250 с использованием чувствительной к метилированию системы Eco RI+ Eag I/StB12.3, случаи неметилированных полных мутаций составляют незначительные доли процента и представляют скорее научный, чем диагностический интерес, не оказывая значительного влияния на точность диагностики. Более того, эти исключения являются очень веским подтверждением общего правила о доминирующем влиянии уровня метилирования CpG-островка гена FMR 1 на степень выраженности умственной отсталости у больных СМБ. Необходимо принять во внимание, что все эти случаи представляли собой крайние варианты соматического мозаицизма по числу повторов (гибридизационная картина в виде сильно размытой зоны в широком диапазоне длин фрагментов ДНК), что позволяет предположить наличие у этих больных фракции аллелей с полной мутацией и метилированием CpG-островка, настолько незначительной, что чувствительность метода блот-гибридизации не позволяет ее выявить. Если такая фракция действительно существует, она может быть выявлена с помощью более чувствительного метода - ПЦР. Однако независимо от результатов такого исследования, приходится признать существование пациентов с полной мутацией, у которых, по крайней мере, подавляющее число полномутационных аллелей неметилировано. Интересна корреляция между изменениями генотипа у этих пациентов и фенотипическими проявлениями СМБ, особенно умственной отсталостью. Во всех описанных в литературе случаях пациенты с неметилированными полными мутациями имели IQ>70, т.е. они не были умственно отсталыми, что позволило назвать их «high functioning fragile X males» - мужчинами с высоким уровнем функционирования при СМБ. Это наблюдение согласуется с результатами ряда проведенных ранее исследований, свидетельствующих о приоритете степени метилирования промотора гена FMR 1 над уровнем экспансии CGG-повтора в подавлении продукции FMRP. Таким образом, пациенты, у которых методом ПЦР не выявляется метилирование области CpG-островка гена FMR 1, даже при наличии полной мутации CGG-повтора, будут проявлять лишь незначительные признаки СМБ при IQ выше 70 и, очевидно, не попадут в группу пробандов с подозрением на СМБ.

Анализ метилирования промоторной области гена FMR 1 методом МЧ-ПЦР – оптимальный на сегодняшний день метод диагностики СМБ. Тем не менее, существенным ограничением метода является его применимость только к пациентам мужского пола и неинформативность при анализе образцов пациентов женского пола вследствие облигатного метилирования у них, по крайней мере, одной копии гена FMR 1 (см. рис.33). Удовлетворительные результаты дает косвенная диагностика носительства у женщин (описана ниже), при наличии в родословной больного с подтвержденным диагнозом СМБ. Однако применение такого подхода возможно только при условии доступности образцов ДНК ближайших родственников, и, кроме того, результаты косвенной диагностики не позволяют дифференцировать состояния премутации и полной мутации в случае подтверждения наследования поврежденного аллеля FMR 1. Прямая диагностика СМБ у женщин требует применения более сложных методов, таких, как анализ аллельного метилирования либо прямое определение длины CGG-повтора в первом экзоне FMR 1. До недавнего времени подобные исследования были возможны только с применением гибридизации ДНК по Саузерну. В последнее время в эпигенетических исследованиях, в том числе при разработке диагностических протоколов, все большее место занимает МС-ПЦР, основанная на использовании образцов ДНК, модифицированной бисульфитом натрия. На основе МС-ПЦР разрабатываются методики определения аллельного метилирования, позволяющие полностью избежать использования гибридизации ДНК в лабораторной диагностике ряда заболеваний. Применительно к диагностике СМБ преимущества МС-ПЦР могут быть использованы не только для облегчения прямого ПЦР-анализа длины CGG-повтора (см. рис. 31, 32) но и для характеристики состояния метилирования промоторной области FMR 1 у женщин.

Анализ метилирования FMR 1 методом МС-ПЦР проводится на основе сравнения интенсивностей сигналов амплификации, соответствующих метилированному и неметилированному аллелям. При этом в качестве внутреннего контроля используется участок гена XIST, дифференциально метилированного на активной и инактивированных Х-хромосомах. Поскольку промотор гена XIST метилирован на активной Х-хромосоме, состояние его аллельного метилирования противоположно таковому гена FMR 1. Поэтому продукты амплификации участка промотора XIST не только обеспечивают оптимальный контроль качества ПЦР, но и могут быть использованы как референсные при полуколичественном анализе метилирования FMR 1.

В результате, сочетание анализа аллельного метилирования и прямого определения длины тринуклеотидного повтора в гене FMR 1 (рис. 34) позволяет не только проводить ДНК-диагностику носительства СМБ у пациентов женского пола, но и четко дифференцировать состояния нормы, премутации и полной мутации.

Следует учитывать, что любые методики, основанные на определении состояния метилирования промотора FMR 1, неприменимы для пренатальной диагностики, если материалом выступает биоптат хориона. Характер метилирования промотора FMR 1 в ворсинах хориона не отражает реального характера метилирования в тканях плода. При осуществлении пренатальной диагностики СМБ, а также и при уточнении возможности носительства у женщин, в случаях спорных или неоднозначных результатов описанных выше диагностических тестов прибегают к косвенной ДНК-диагностике заболевания, которая осуществляется путем анализа наследования аллелей миросателлитных маркёров в семьях с СМБ. На рис.35 схематично представлено расположение полиморфных повторов, традиционно используемых в косвенной диагностике СМБ: DXS548, FRAXAC1 и FRAXAC2. При обследовании десятков трёхпоколенных семей ни одного рекомбинационного события между этими маркёрами и CGG-повтором в гене FMR1 выявлено не было.

Для определения применимости указанных маркёров для косвенной ДНК-диагностики СМБ в России нами проведено определение некоторых популяционных характеристик этих маркёров в нормальной популяции и в семьях с СМБ. Расчёт гетерозиготности маркёров DXS548 и FRAXAC1 проведён на 200 неродственных контрольных хромосомах и 35 неродственных СМБ-хромосомах с полной мутацией в гене FMR1. Гетерозиготность DXS548 и FRAXAC1 составила соответственно 30% и 32% в контрольной группе против 65% и 63% у больных. Эти данные аналогичны данным по гетерозиготности DXS548 и FRAXAC1 во всех исследованных популяциях европейцев. Низкая гетерозиготность не позволяет получать достаточно информативные результаты при использовании только одного маркёра, а требует анализа гаплотипов по всем трём маркёрам - DXS548, FRAXAC1 и FRAXAC2. Для определения стабильности наследования DXS 548, FRAXAC 1 и FRAXAC 2 в норме и при СМБ мы провели анализ мейозов в 35 контрольных семьях и 35 семьях с СМБ (47 и 54 женских мейозов, соответственно). Во всех семьях наблюдался менделевский характер наследования всех трёх маркёров.

С целью повышения информативности панели маркеров для косвенной диагностики СМБ нами были дополнительно охарактеризованы три микросателлитных повтора, фланкирующих ген FMR 1 – DXS 998, DXS 8091 и DXS 1691 (рис.35). Гетерозиготность этих микросателлитов в нормальной популяции составила соответственно 65%, 70% и 29%.

Х-сцепленный характер наследования СМБ облегчает анализ сцепления в семьях, поскольку в большинстве случаев пробандами являются больные с УО мужского пола и гаплотип его единственной Х-хромосомы представляет собой гаплотип хромосомы с мутацией в FMR 1. Особенно перспективно использование анализа сцепления в преимплантационной диагностике СМБ, когда применение других методов ДНК-диагностики проблематично.

 

5.5.2. Совместный анализ метилирования CpG-островков, прилежащих к ломким участкам FRAXA, FRAXE и FRAXF.

Цитогенетический анализ не всегда позволяет точно определить расположение ломкого участка на хромосоме. Особенно это относится к близко расположенным ломким участкам FRAXA, FRAXE и FRAXF. Известно, что FRAXE и FRAXF были впервые обнаружены при скрининге умственно отсталых больных с целью выявления СМБ, когда в нескольких образцах с цитогенетически подтверждённой ломкостью в X(q27.3-q28) не обнаружилось характерных для СМБ изменений ДНК. 

Среди больных с документированной хромосомной ломкостью в дистальной части длинного плеча Х-хромосомы, для которых нами была проведена ДНК-диагностика, в 18% случаев (3 из 17) диагноз СМБ не подтвердился ни при использовании блот-гибридизации, ни в метилчувствительной ПЦР.

Традиционным методом выявления экспансии тандемных повторов в FRAXEи FRAXF является Саузерн-гибридизация со специфическими ДНК-зондами: OxE20 и pR15.0 соответственно. Эти зонды представляют собой фрагменты геномной ДНК, расположенной вблизи гипервариабельных областей гена FMR 2 и локуса FRAXF.

При гибридизации зонда OxE20 с геномной ДНК здоровых индивидов, гидролизованной рестриктазой HindIII, выявляется фрагмент длиной 5,2 т.п.н. Анализ метилирования промоторной области гена FMR 2 проводится в системе HindIII+NotI/OxE20. Длина выявляемого при этом нормального неметилированного фрагмента ДНК составляет 2,8 т.п.н. Блот-гибридизационный анализ гипервариабельного района FRAXE с использованием зонда OxE20 можно проводить на нейлоновых или нитроцеллюлозных фильтрах, предварительно использованных для диагностики СМБ с зондами StB12.3, Ox1.9 и др., что позволяет сократить время выполнения анализа и расход материалов и реактивов. Недостатки использования гибридизации по Саузерну как метода ДНК-диагностики УО FRAXEте же, что и при использовании её для ДНК-диагностики СМБ. Кроме того, при гибридизации зонда OxE20 с геномной ДНК, гидролизованной HindIII, в качестве полиморфного варианта выявляется фрагмент длиной 6,4 т.п.н., осложняющий интерпретацию результатов анализа. Выявление гибридизационного сигнала в районе 6,4 т.п.н. создаёт необходимость дополнительного анализа ДНК обследуемого в системе BamHI/OxE20.

ПЦР-амплификация областей повторов в FRAXE и FRAXF сопряжена с теми же трудностями, что и в случае повтора в FRAXA, что не позволяет использовать ПЦР-анализ для широкой диагностики и скрининга FRAXE и FRAXF.

Традиционные протоколы диагностики FRAXE и FRAXF излишне сложны, дороги и трудоёмки. Нами разработан протокол метилчувствительной ПЦР, позволяющий определять состояние метилирования CpG-островков всех трёх участков – FRAXA, FRAXE и FRAXF – в одной пробирке.

Реакционная смесь для одновременного анализа состояния метилирования CpG-островков трёх ломких участков содержит три пары олигонуклеотидных праймеров. Праймеры для анализа метилирования FRAXA уже применялись нами для изолированного ПЦР-анализа метилирования промотора гена FMR 1. Праймеры для анализа метилирования CpG-островков, прилежащих к FRAXE и FRAXF, обеспечивают амплификацию участков геномной ДНК длиной соответственно 231 п.н. и 271 п.н., содержащие соответственно 3 и 6 сайтов узнавания рестриктазы HhaI, обеспечивая, таким образом, достаточную полноту рестрикции матрицы. Поскольку точной карты метилирования CpG-островков FRAXE и FRAXF не существует, a priori нельзя было предполагать, что конкретный дизайн праймеров обеспечит удовлетворительную чувствительность и специфичность метода. Поэтому для его валидации была проведена апробация протокола в контрольных группах, состоявших из 30 здоровых женщин, 30 здоровых мужчин, 30 больных мужского пола с метилированным промотором FMR 1 и 8 больных мужского пола с экспансией тринуклеотидного повтора в области FRAXE. Наличие у этих больных экспансии в области FRAXE было подтверждено ранее методом блот-гибридизации с зондом OxE20.

Совместный анализ метилирования FRAXA, FRAXE и FRAXF в перечисленных контрольных группах показал полное отсутствие метилирования исследуемых фрагментов у всех здоровых мужчин, метилирование всех трёх CpG-островков у женщин, и метилирование только FRAXA или только FRAXE у больных с СМБ и УО FRAXE соответственно (рис.36).

Таким образом, можно говорить об удовлетворительной чувствительности и специфичности протокола в плане выявления аномального метилирования FRAXA и FRAXE у мужчин и, по крайней мере, об отсутствии ложноположительных результатов при анализе метилирования FRAXF.

Совместный анализ метилирования CpG-островков FRAXA, FRAXE и FRAXF позволяет эффективно выявлять среди умственно отсталых больных не только таковых с СМБ и УО FRAXE. В трех из 470 образцов ДНК пробандов мужского пола с различной степенью УО, обследованных этим методом, нами выявлено совместное метилирование всех трёх анализируемых участков. Амплификация Y-сцепленного гена SRY дала положительные результаты во всех случаях, подтвердив мужской пол пробандов. Один из образцов принадлежал мальчику 6 мес. с предварительным диагнозом «синдром Дауна» и был исследован нами в рамках скрининга больных с неспецифической УО. При анализе кариотипа больного (результат - 49,XXXXY) синдром Дауна подтверждён не был, однако было получено объяснение метилированному состоянию CpG-островков FRAXA, FRAXE и FRAXF. Очевидно, что при таком кариотипе все Х-хромосомы, кроме одной, должны быть инактивированы в порядке дозовой компенсации. Кариотипирование двух других больных с метилированием всех трёх ломких участков на Х-хромосоме показало наличие недиагностированного синдрома Клайнфельтера, при котором в ряде случаев наблюдается умственная отсталость. Очевидно, в эту же группу попадут больные с любым другим кариотипом, включающим, по крайней мере, одну дополнительную Х-хромосому. Возможность выявления, кроме СМБ, УО FRAXE и аномального метилирования FRAXF, лиц мужского пола с дополнительными Х-хромосомами, расширяет область применения совместного теста на метилирование FRAXA, FRAXE и FRAXF. Одним из возможных приложений метода может стать скрининг новорожденных мужского пола.